Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Хроматография белков
Фракционирование белков сыворотки на колонке с ДЭАЭ-сефадексом

Принцип метода. Белки, связанные на колонке с ДЭАЭ-сефадексом при данном значении pH, элюируют, снижая pH и увеличивая ионную силу элюента.

Область применения. Фракционирование на ДЭАЭ-сефадексе с успехом можно использовать во всех областях биохимии, белковой химии, иммунологии и клинической химии для выделения белковых фракций.

МЕТОДИКА

1. Подготовка колонки. Для анионообменной хроматографии белков обычно применяют ДЭАЭ-сефадекс А-50. 1,0 г ионообменника суспендируют в дистиллированной воде и оставляют на 1 ч, после чего надосадочную жидкость вместе с медленно оседающими мелкими частичками декантируют. Затем ионообменник отмывают от ионов СГ 0,5 М NaOH. Избыток щелочи отмывают дистиллированной водой и продолжают дальнейшее отмывание кислотой. В связи с тем, что белки сыворотки крови обычно фракционируют в фосфатном буферном растворе, в качестве кислого отмывающего раствора применяют 0,1 М фосфорную кислоту. Избыток кислоты в свою очередь отмывают дистиллированной водой, а затем ионообменник отмывают стартовым буферным раствором до тех пор, пока не наступит равновесие. Проще всего отмывание вести фильтрованием на воронке Бюхнера, поскольку при этом удобно не только отмывать, но и анализировать промывную жидкость.

Подготовить ДЭАЭ-сефадекс к хроматографии можно и другим способом: ионообменник на сутки оставляют набухать в большом избытке стартового буферного раствора, несколько раз меняя его. Если через сутки не наступит равновесие, то смену надосадочной жидкости продолжают до тех пор, пока ее pH не будет равен pH стартового буферного раствора.

2. Заполнение колонки ионообменником. К набухшему и уравновешенному стартовым буферным раствором ДЭАЭ-сефадексу добавляют немного буферного раствора и, закрыв выходное отверстие, полученной негустой, тщательно перемешанной суспензией заполняют колонку, в которую предварительно на одну треть высоты наливают стартовый буферный раствор. Затем выходное отверстие открывают и продолжают постепенно заполнять колонку ионообменником до нужной высоты. После этого проверяют, уравновешена ли колонка; если равновесия нет, ее продолжают промывать стартовым буферным раствором до тех пор, пока pH вытекающей жидкости не будет равен pH стартового буферного раствора.

3. Подготовка системы для градиентного элюирования. В качестве смесителя используют колбу на 0,5 л со стартовым буферным раствором (0,02 М фосфатный буфер pH 8,0). Резервуар, образующий замкнутую систему со смесителем, представляет собой сосуд объемом 1 л, заполненный 0,3 М буферным раствором. Непрерывную подачу буферного раствора на колонку осуществляют с помощью насоса. Открыв выходное отверстие, понижают уровень буферного раствора в колонке до уровня геля. Затем на ионообменник аккуратно, стараясь не взмутить верхний слой геля, наносят фракционируемую сыворотку, которую предварительно в течение суток диализуют против стартового буферного раствора. Нанесенный образец смывают тремя порциями стартового буферного раствора по 2 мл и приступают к хроматографии. Для фракционирования 3 мл сыворотки требуется колонка ДЭАЭ-сефадекса размером 2x50 см:

4. Хроматография. Хроматографию проводят так же, как описано для колонки с ДЭАЭ-целлюлозой (см. стр. 209).

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Закончив хроматографию, гель сефадекса сразу же извлекают из колонки и регенерируют. Прежде всего нужно удалить белки, которые, по всей вероятности, остаются адсорбированными на ионообменнике. Это достигается отмыванием геля в 1 М Na₂HPО₄ с последующим отмыванием дистиллированной водой до нейтральной реакции (до pH дистиллированной воды). После этого гель ионообменника уравновешивают стартовым буферным раствором.

2. Емкость ДЭАЭ-сефадекса обычно составляет 3 мэкв/г. В соответствии с этим на колонку ДЭАЭ-сефадекса, приготовленную из 1,0 г сухого ионообменника, можно нанести 3 мл сыворотки.

3. При уменьшении ионной силы буферного раствора ионообменные сефадексы очень сильно набухают, поэтому не рекомендуется применять растворы, ионная сила которых ниже 0,05—0,1. Если хроматографию начинают в слишком разбавленном буферном растворе, то при последующем значительном увеличении ионной силы элюирующего буферного раствора происходит уменьшение объема гранул сефадекса, которое может вызвать образование полостей в колонке геля. Образование полостей нарушает равномерное протекание жидкости через колонку и неблагоприятно отражается на результатах хроматографии.

4. Рекомендуется проводить регенерацию геля ДЭАЭ-сефадекса после извлечения его из колонки и перед каждым опытом заполнять колонку вновь; благодаря этим операциям гель становится гомогенным.

5. Хроматография на ДЭАЭ-сефадексе очень удобна для выделения из сыворотки IgG и для разделения белков этой фракции, обладающих разной электрофоретической подвижностью. Стартовый буферный раствор сначала вымывает из колонки IgG, имеющие низкую электрофоретическую подвижность. Быстро мигрирующие белки этого же класса выходят только при градиентном элюировании. Хроматография на ДЭАЭ-сефадексе является также общепринятой методикой очистки миеломных IgG.

6. Для катионообменной хроматографии можно использовать КМ-сефадекс G-50. Его предварительную обработку следует проводить так же, как и ДЭАЭ-сефадекса, с той лишь разницей, что КМ-сефадекс сначала обрабатывают 0,5 н. НСl, а затем отмывают щелочью. Процедура хроматографии на КМ-сефадексе G-50 та же, что и на КМ-целлюлозе.

7. По размеру пор ионообменные сефадексы подразделяются на два вида и имеют индексы 25 и 50. Ионообменник с индексом 25 имеет поры меньшего размера, чем сефадекс с индексом 50. Как и при гель-фильтрации, размер пор определяет величину молекул, которые могут диффундировать в гранулы сефадекса. Поэтому для разделения веществ с молекулярным весом меньше 10 000 используют сефадексы с индексом 25, а для разделения веществ с более высоким молекулярным весом применяют сефадексы с индексом 50. Очень большие молекулы не могут проникнуть внутрь гранул сефадекса и адсорбируются на их поверхности. Для фракционирования соединений большого молекулярного веса можно использовать ионообменные сефадексы с любым размером пор.

8. Ионообменные сефадексы производятся в виде гранул диаметром 40—120 мкм, шарообразная форма которых обеспечивает высокую скорость протекания жидкости через колонку. Однако не следует забывать, что набухшие гранулы сефадекса легко подвергаются деформации. Поэтому попытка увеличить скорость протекания повышением давления подаваемого на колонку раствора выше определенного предела может, наоборот, привести к ее уменьшению.

9. pH и ионная сила буферного раствора также влияют на процесс набухания гранул сефадекса и, следовательно, на скорость протекания жидкости через колонку. Для этих параметров следует подобрать такие значения, чтобы максимальное набухание сефадекса или его сжатие не нарушало бы процесса хроматографии.

10. Для оптимального фракционирования очень важно правильно рассчитать количество загружаемого в колонку ионообменника. В каждом конкретном случае рекомендуется в предварительных опытах определить оптимальные размеры колонки. Практика показывает, что для получения хороших результатов высота колонки должна относиться к ее диаметру как 10:1.

11. Набухшие ионообменники можно хранить в виде суспензии в нейтральных растворах в течение нескольких месяцев даже при комнатной температуре, если принять меры предосторожности против бактериального заражения. В суспензии КМ- и сульфоэтил-сефадекса (СЭ-сефадекс) добавляют 0,02 % азида натрия, а в суспензию ДЭАЭ-сефадекса — 1 % бутанола.