Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Хроматография белков
Выделение IgG из сыворотки крови с помощью бесколоночного фракционирования на ДЭАЭ-сефадексе

При соответствующих условиях ДЭАЭ-сефадекс связывает все белки сыворотки, за исключением фракции IgG. Поэтому фракционирование белков сыворотки с помощью этого ионообменника очень удобно для выделения иммунохимически чистого IgG, а также полезно при дальнейшей очистке препаратов IgG, полученных другими способами.

Суть бесколоночного метода заключается в следующем. Фракционируемую сыворотку смешивают с уравновешенным соответствующим буферным раствором ДЭАЭ-сефадексом, который связывает почти все сывороточные белки, оставляя в растворе IgG, легко отделяемый при отмывании. Смешивание с ДЭАЭ-сефадексом повторяют дважды (каждый раз со свежей порцией ионообменника) и в результате получают препарат IgG, свободный от примеси других белков сыворотки, о чем судят по иммуноэлектрофоретическому анализу. Благодаря тому что фракция IgG совсем не связывается с ионообменником, белки этого класса удается выделить почти количественно в нативном состоянии, не опасаясь денатурации, что является большим преимуществом данного метода по сравнению с другими методами выделения IgG.

МЕТОДИКА

ДЭАЭ-сефадекс обрабатывают так же, как и для колоночной хроматографии, затем уравновешивают 0,01 М фосфатным буферным раствором pH 6,5. Когда уравновешивание закончится, буферный раствор удаляют, насколько это возможно, так, чтобы ионообменник оставался едва влажным. Удобнее всего это сделать, поместив ДЭАЭ-сефадекс на выстланную фильтровальной бумагой воронку Бюхнера и пропуская через него буферный раствор под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом.

Фракционируемую сыворотку (1—30 мл) наливают в химический стакан, добавляют к ней необходимое количество влажного ионообменника и перемешивают до получения гомогенной суспензии. Смесь оставляют при 4° С на 1 ч и затем переносят на фильтровальную бумагу, выстилающую воронку Бюхнера. Гель промывают холодным 0,01 М фосфатным буферным раствором pH 6,5 до тех пор, пока в элюате не перестанет обнаруживаться белок (в реакции с сульфосалициловой кислотой). Собранный буферный раствор, содержащий белок, смешивают со свежей порцией ДЭАЭ-сефадекса, полученную суспензию вновь оставляют при 4° С на 1 ч и снова, как описано выше, отмывают белок, не связавшийся с ионообменником. Отмывающий буферный раствор, который в данном случае уже содержит только чистый IgG, можно лиофилизировать или сконцентрировать диализом под давлением.

Рекомендуемая литература

Delermann H., Gel Chromatography, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1968. (Г. Детерман, Гель-хроматография, изд-во “Мир”, М., 1970).

Leach S. J., Physical Principles and Techniques of Protein Chemistry, Academic, Press, New York, London, 1969.

Williams C. A., Chase M. W., Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. II, Academic Press, New York, London, 1968.