Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Гель-фильтрация белков и пептидов
Предварительное фракционирование ферментативных гидролизатов на колонке с сефадексом G-50

При специфическом ферментативном гидролизе или химическом расщеплении любого белка среднего молекулярного веса получается довольно сложная смесь пептидов. Выделение и очистка всех пептидов, из которых состояла полипептидная цепь и которые содержатся в нефракционированном гидролизате, — задача достаточно трудная. Поэтому гидролизат белка рекомендуется сначала подвергнуть предварительному разделению. Среди современных методов фракционирования наиболее подходящим для этой цели является гель-фильтрация.

1. Обработка сефадекса G-50. Сефадекс суспендируют в 10-кратном объеме 0,01 М NH₄OH, перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и оставляют для отстаивания. После этого ладосадочную жидкость, содержащую мелкие частицы геля, декантируют, а суспендирование и отстаивание повторяют. Затем гель сефадекса суспендируют в 3-кратном объеме 0,01 М NH₄OH и загружают в колонку, через которую пропускают 5 объемов 0,01 М NH₄OH.

2. Выбор размеров колонки. Предварительное фракционирование 100—200 мг гидролизата проводят на колонке размером 1,5 х 150 см.

3. Подготовка материала для фракционирования. Фракционируемый материал следует наносить на колонку в минимальном объеме. 100—200 мг гидролизата обычно растворяют в 3—5 мл 0,01 М NH₄ОН.

4. Нанесение образца. Открыв выходное отверстие колонки, выпускают избыток буферного раствора, так чтобы его уровень был всего лишь на 1 мм выше уровня геля сефадекса. Затем, касаясь загнутым концом пипетки стенки колонки, круговыми движениями руки наслаивают на сефадекс раствор фракционируемого материала. После этого кран выходного отверстия колонки вновь открывают и дают возможность нанесенному препарату медленно войти в гель. Остаток препарата смывают тремя порциями 0,01 М NH₄OH по 1 мл. Верхнюю часть колонки заполняют 0,01 М NH₄OH и соединяют колонку со склянкой Мариотта или насосом.

5. Элюирование. Элюирование производят 0,01 М NH₄OH со скоростью 300 мл/ч и собирают фракции по 3—5 мл. Фракции объединяют в соответствии с кривой оптической плотности элюата при 280 нм, полученной на “Увикорде” или после измерений в спектрофотометре. Объединенные фракции лиофилизируют.

После элюирования колонку отмывают не менее чем двумя объемами раствора 0,01 М NH₄OH и используют вновь. После 4—5 опытов фракционирования гель сефадекса необходимо извлечь из колонки и промыть раствором NH₄OH. В связи с опасностью бактериального роста не рекомендуется держать колонку при комнатной температуре.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. В соответствии с механизмом гель-фильтрации при выборе марки (G-индекса) сефадекса следует руководствоваться предполагаемой величиной молекулярного веса пептидов. Если гидролизат содержит крупные пептиды, целесообразно использовать сефадекс G-50 или G-75. Если средняя величина молекулярного веса пептидов невелика, то предварительное фракционирование проводят на сефадексе G-25. Чем выше специфичность расщепления (например, при действии трипсина на ацетил- и трифторацетилбелки или при расщеплении бромцианом), тем больше вероятность получения крупных пептидов. В этих случаях используется сефадекс с более высоким значением индекса G. При неспецифическом гидролизе (гидролиз химотрипсином, субтилизином, папаином, пепсином, кислотой и т. п.) обычно получаются мелкие пептиды, которые следует предварительно фракционировать на сефадексах с низким значением индекса G.

2. Из-за абсорбционных свойств сефадекса выход материала при фракционировании гидролизатов белка обычно равен 55—60%.

3. С помощью измерения оптической плотности растворов при 280 нм могут быть обнаружены только пептиды, содержащие тирозин и триптофан. Для выявления пептидов, не имеющих в своем составе этих аминокислот, необходимо располагать другими методами определения пептидов. К ним относится, например, метод прямой спектрофотометрии при 220 нм; поглощение при этой длине волны характерно для соединений с пептидными связями.

Трудоемким, но очень чувствительным методом анализа отдельных фракций может служить нингидриновая реакция. Из каждой фракции отбирают равные пробы объемом 0,2—0,3 мл, добавляют к ним по 1 мл 2,5 н. NaOH и инкубируют 3 ч при 90° С. Затем к каждой пробе добавляют по 1 мл 30%-ной уксусной кислоты, 0,25 мл 0,2%-ного раствора SnCl₂ в 0,2 М нитратном буферном растворе и 0,25 мл 4%-ного раствора нингидрина в пропаноле. Пробы на 10 мин помещают в кипящую водяную баню при 100°С, затем к каждой, добавляют по 3 мл 50%-ного пропанола и определяют оптическую плотность при 570 нм.

4. Предварительное фракционирование на колонке с сефадексом очень удобно для выделения и очистки компонентов смеси, избирательно помеченных радиоактивными изотопами. В этом случае кроме определения концентрации пептидов спектрофотометрией или с помощью нингидриновой реакции, измеряют также радиоактивность полученных фракций в соответствующем приборе (в сцинтилляционном или других счетчиках).

5. Предварительное фракционирование с помощью полиакриламидного геля дает такие же результаты, как и гель-фильтрация на сефадексе. В отличие от природного декстранового геля, каким является сефадекс, полиакриламидный гель представляет собой гель синтетического полимера, обладающий чрезвычайно малыми абсорбционными свойствами. Поэтому разделение на полиакриламидном геле можно провести практически без потерь фракционируемого материала. Молекулярный вес фракционируемых веществ также очень существен для разделения на полиакриламидном геле. Чем ниже молекулярный вес компонентов разделяемой смеси, тем меньше индекс биогеля, который целесообразно использовать для фракционирования.