Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Тонкослойная хроматография (Д. А. Медьеши)

Смеси можно хроматографировать не только на колонках пористого геля, но и в однородном тонком слое адсорбента. Тонкослойная хроматография получила широкое распространение в современной лабораторной практике начиная с 1956—1958 гг. после того, как Сталь [16] описал простую стандартную методику приготовления тонкого слоя адсорбента.

В тонком слое адсорбента, главным образом силикагеля или окиси алюминия, можно проводить микроанализ смеси липофильных веществ так же просто, как и хроматографией на бумаге. Область применения этого метода быстро расширялась, и в настоящее время с его помощью проводят анализ гидрофильных соединений, которые можно фракционировать и на бумаге, но тонкослойная хроматография на порядок чувствительнее и проходит значительно быстрее.

Для приготовления слоя готовят густую водную суспензию адсорбента и наносят ее на пластинку из стекла, пластмассы или алюминиевой фольги. В продаже имеется специальный прибор для нанесения слоев адсорбента строго воспроизводимой толщины (фирмы Desaga и Camag). В прибор любой конструкции входит лоток, заполняемый гелем, один край которого (наносящий край) установлен на соответствующем расстоянии от стеклянной пластинки. Изменяя это расстояние, можно наносить слои адсорбента различной толщины. При движении пластинки относительно лотка (в приборе фирмы Desaga) или лотка относительно пластинки (в приборе фирмы Camag) тщательно отшлифованная поверхность стекла покрывается ровным слоем влажного адсорбента (фиг. 44). Существует два типа данных приборов — с ручным и механическим управлением передвижения пластинки. В приборе венгерской фирмы Labor стеклянная пластинка скользит под давлением водопроводной воды.

После нанесения слоя адсорбента пластинки высушивают на воздухе и далее обрабатывают согласно выбранной методике (например, прогревают при 60—120° С, “активируют” и т. д.). Прогретые пластинки можно хранить в эксикаторе.

Исследуемый препарат наносят на пластинку микропипеткой в одну точку или по линии. Линия получается при нанесении ряда точек или с помощью имеющегося в продаже специального шприца. В довольно широких пределах количество наносимого материала не влияет на миграцию разделяемых веществ. Однако, если на пластинку нанести слишком много материала, возможна деформация пятен. Пределы разрешения и оптимальное количество наносимого препарата в каждом конкретном случае варьируют в зависимости от свойств адсорбента и фракционируемой смеси.

Фиг. 44. Прибор для нанесения слоя носителя на пластинки для тонкослойной хроматографии.

Обычно проводят восходящую тонкослойную хроматографию, используя для этого стеклянные хроматографические камеры с крышками, обеспечивающими герметичность. Растворитель наливают на дно такой камеры и погружают в него нижний край хроматографической пластинки (фиг. 45). При тонкослойной хроматографии приходится учитывать особенность, не встречающуюся при хроматографии на колонке, — испарение растворителя с поверхности слоя, в результате которого увеличивается время миграции данного вещества. Из растворителя, имеющего сложный состав, в первую очередь испаряются наиболее летучие компоненты, что ведет к изменению исходного соотношения компонентов смеси. Интенсивность испарения снижается в направлении от краев к центру пластинки, поэтому происходит искривление фронта растворителя, и в результате величина R_f на краях хроматограммы будет больше, чем в центре. Испарение растворителя при тонкослойной хроматографии ухудшает воспроизводимость величины R_f. Чтобы устранить этот источник артефактов, следует постоянно поддерживать в камере атмосферу насыщенных паров. Это достигается выстиланием стенок камеры фильтровальной бумагой, смоченной растворителем, или уменьшением до минимума объема хроматографической камеры (сэндвич-камера).

Фиг. 45. Хроматографическая камера и ее насыщение парами растворителя.

А. Камера с жидкой фазой, налитой на дно. Б. Камера, стенки которой выстланы фильтровальной бумагой, смоченной жидкой фазой, для создания равномерно насыщенной парами растворителя атмосферы. 1 — пластинка с нанесенным слоем адсорбента; 2 — пары растворителя; 3 — смоченная растворителем фильтровальная бумага; 4 — многокомпонентный растворитель.

Фиг. 46. Схема горизонтальной хроматографической камеры Бреннера и Нидервизера (BN-камера).

1 — покровная пластинка; 2—фитиль из фильтровальной бумаги, подающий растворитель на слой адсорбента; 3 — пластинка, используемая в качестве подложки для слоя адсорбента; 4 — резервуар для растворителя; 5 — поддерживающий камеру корковый круг; 6 — пружинный зажим.

Существует несколько способов дальнейшего улучшения разделения при тонкослойной хроматографии. Например, можно повторно подавать тот же самый растворитель на пластинку или, прервав хроматографию на определенном этапе, после того как разделяемые вещества уже мигрировали на некоторое расстояние, высушить пластинку и затем продолжать хроматографию с другим растворителем. Для длительной хроматографии Бреннером и др. [4] предложена специальная камера, представленная на фиг. 46. В этом приборе хроматографическая пластинка расположена горизонтально, а растворитель подается на один край пластинки с помощью фитилей из фильтровальной бумаги. Почти вся поверхность пластинки закрыта крышкой, за исключением полоски шириной 2 см на противоположном по отношению к сосуду с растворителем конце. Растворитель испаряется со свободной поверхности этого конца пластинки, чем обеспечивается постоянный ток элюента, и поэтому хроматографию можно вести как угодно долго.

Подобно хроматографии на бумаге, при тонкослойной хроматографин также проводят разделение в двух направлениях под прямым углом друг к другу. В одном направлении, как правило, проводят электрофорез в электрофоретической камере с малым объемом для испарения; контакт между слоем адсорбента и электродными отсеками в этих камерах обеспечивают фитили из фильтровальной бумаги. Из-за низкой теплопроводности стекла и связанным с этим слабым тепловым рассеянием может возникать проблема охлаждения хроматографической пластинки. Для снижения образования тепла рекомендуется работать на стеклянных пластинках минимальной толщины и применять буферные растворы по возможности минимальной ионной силы.

Полученные фракции проявляют, опрыскивая тонкий слой соответствующими реагентами. При работе на неорганических адсорбентах в качестве таких реагентов могут быть использованы вещества, обычно разрушающие бумагу, например сильные кислоты.

Проявленные хроматограммы, как правило, фотографируют. После опрыскивания специальным раствором полимеров (Neatan) слой адсорбента можно отделить от стекла и сохранить в качестве иллюстрирующего материала эксперимента.