Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Ионообменная хроматография в фиксированном слое ионообменника

Ионообменная тонкослойная хроматография в фиксированном слое ионообменной смолы — новый метод в биохимии. Бесспорно, в настоящее время среди известных способов фракционирования ионообменная хроматография является лучшим. В течение двух последних десятилетий это было подтверждено многочисленными экспериментами.

Ионообменная хроматография дала возможность автоматизировать анализ аминокислот, что открыло новую эпоху в биохимии белка и ряде других областей молекулярной биологии. Однако при применении классической ионообменной хроматографии на колонках чрезвычайно большую роль играет фактор времени. Основные проблемы в методах хроматографии на колонке возникают при оценке фракционирования и проведении параллельных экспериментов.

Из характера метода следует, что для оценки требуется сложная по конструкции и дорогая полуавтоматическая или автоматическая аппаратура. Если же ее нет, неавтоматическое фракционирование, при котором каждую фракцию из коллектора нужно отдельно проанализировать, требует больших затрат времени.

Производительность автоматического аминокислотного анализатора определяется числом анализируемых проб за данный промежуток времени; совершенно очевидно, что она значительно превышает производительность неавтоматического фракционирования.

Ясно, что для проведения параллельных опытов нужно иметь либо несколько автоматических установок, что с финансовой точки зрения допустимо лишь для небольшого числа лабораторий, либо большой штат научных сотрудников. Однако во многих случаях возникает необходимость проведения большого числа анализов. Например, при исследовании структуры белка для определения полной аминокислотной последовательности белка со средним молекулярным весом требуется проделать около 3—4 тыс. анализов.

¹ Данная глава прислана Т. Дэвени специально для русского издания.— Прим. ред.

Приблизительно столько же испытаний необходимо провести при селекции растений для отбора одного нового вида с повышенным содержанием белка или более высоким содержанием Лиз и Мет. В клинической практике также имеется область, где анализ аминокислот используется в массовых обследованиях для выявления нарушений аминокислотного метаболизма у новорожденных. Во многих странах такое обследование уже введено в обязательном порядке, правда, с применением микробиологических методов, поскольку исследование огромного числа образцов другими методами аминокислотного анализа реально не выполнимо.

Ясно, что в таких исследованиях метод колоночной хроматографии неприменим, тогда как тонкослойная хроматография — очень простая, быстрая и удобная процедура, при которой разделяемые вещества обнаруживаются достаточно легко; она не требует дорогостоящей аппаратуры и применима для массовых испытаний. Правда, ее разрешающая способность значительно уступает колоночной ионообменной хроматографии. Несмотря на это, относительно молодая методика быстро распространяется во всех областях химии, и это не случайно.

Для разделения, например, смеси из 16 аминокислот хроматографию в тонком слое, как и хроматографию на бумаге, необходимо проводить в двух направлениях. Это снижает ценность метода, так как двумерные хроматограммы довольно трудно оценивать, особенно когда в пробе имеется больше 16 аминокислот. К тому же при хроматографии в двух направлениях для каждой пробы необходима отдельная пластинка, а это создает дополнительные сложности, связанные с рабочим местом, обработкой хроматограмм и т. д.

Высокая разрешающая способность ионообменной хроматографии и простота тонкослойной хроматографии породили стремление объединить эти два метода и разработать технологию тонкослойной хроматографии в фиксированном слое ионообменника.

Вначале казалось, что осуществить это довольно легко. В тонкослойной хроматографии применяются различные сорбенты (силикагель, окись алюминия, полиамид, различные производные целлюлозы и т. д.) и различные связывающие агенты (гипс, крахмал, декстраи, поливиниловый спирт и т. д.). Предполагали, что эти агенты и условия, при которых они применяются, вполне подходящии для фиксирования смол.

К сожалению, первые эксперименты показали, что дело обстоит не так просто, и для того чтобы проводить хроматографию в слое ионообменника, необходимо разрешить следующие проблемы:

1. Слой должен быть крепким. Его механическая прочность должна быть подобна прочности слоев силикагеля, т. е. он должен быть таким, чтобы его можно было брать руками, писать на нем мягким грифелем и хранить сложенным в стопку.

2. Ионообменная хроматография возможна только в водных растворах: следовательно, слой должен быть влагопрочным.

3. Связывающее вещество не должно уменьшать набухания фиксированного ионообменника (определяемого емкостью) и его разрешающей способности.

4. Слой должен сохранять прочность в органических растворителях, потому что выявление фракционируемых компонентов (например, в реакции с нингидрином) обычно ведут с их использованием (ацетон, бутанол и т. д.).

Нам удалось разработать способ приготовления слоя ионообменной смолы со связывающим веществом, отвечающего всем необходимым требованиям, и найти условия для хроматографии в нем. Наш способ был принят заводом Chinoin-Nagyteteny (Венгрия) и фирмой Machery-Nagel (ФРГ).

В настоящее время в продажу поступили пластинки “Фиксион” венгерского производства и “Ионэкс” немецкого производства.