Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Выделение и очистка белков
Общие рекомендации, соблюдение которых полезно при выделении и очистке белков

Выделение и очистка белков — одна из самых сложных проблем белковой химии. Как правило, в биологических объектах присутствуют смеси и соединения большого числа белков, причем многие из них очень близки друг к другу по физико-химическим свойствам. Нередко наблюдается практическое совпадение отдельных физико-химических характеристик разделяемых белков. Это заставляет прибегать к сочетанию нескольких способов очистки, которые позволяют использовать наиболее Широкий круг возможных различий. Положение осложняется также неустойчивостью белков, опасностью денатурации в процессе очистки, что значительно ограничивает применение многих эффективных приемов. Все это, а также большое разнообразие белков приводит к невозможности рекомендовать какую- то единую схему выделения и очистки. Даже для одного и того же белка предлагают подчас несколько схем, примерно одинаковых по эффективности.

Важной особенностью большинства частных методов выделения и очистки белков является обилие эмпирически установленных деталей процесса. Неукоснительное выполнение рекомендуемых прописей вплоть до, казалось бы, «мелочей» (значение которых бывает иногда не вполне ясным даже автору метода) — обязательное условие успеха.

Ниже излагаются основные общие способы очистки белков, а также примеры того, как разные способы сочетаются в процессе очистки отдельных белков. В заключение рассматриваются критерии полноты очистки белков.

Весь процесс выделения белка следует, как правило, вести при возможно более низкой температуре. Повышение температуры нередко приводит к денатурации белка. Очень важно сохранять температуру низкой даже тогда, когда известно, что в природных условиях данный белок стабилен при относительно высоких температурах. Дело в том, что белок внутри клетки и в малоочищенных препаратах может быть более устойчив, нежели в очищенном виде. Выделение белка при низких температурах имеет и те преимущества, что в этих условиях предотвращается или уменьшается рост микроорганизмов, загрязняющих нестерильно получаемые препараты, и замедляется действие гидролизующих ферментов.

В отношении малоизученных белков следует избегать крайних значений pH, так как большинство белков денатурируется при сильном подкислении или подщелачивании растворов. Большинство белков наиболее устойчивы при pH, близком к нейтральному, хотя есть и исключения (например, гистоны, трипсин, химотрипсин и пепсин более устойчивы при низких значениях pH).

Многие белки быстро денатурируются в присутствии таких агентов, как этанол или ацетон. Поэтому при использовании последних следует соблюдать особую осторожность — работать при отрицательных температурах, быстро их удалять и т. п.

При добавлении кислот, оснований или органических растворителей следует избегать их местного избытка. Реагенты лучше добавлять в виде разбавленных растворов, медленно и при постоянном перемешивании. Взбалтывая растворы белков, следует, однако, избегать образования пены, так как при этом нередко идет денатурация белка на границе раздела фаз.

При получении и очистке белков весьма желательно уже на начальных стадиях работы удалить или инактивировать те ферменты, которые могут гидролизовать белок. Например, при получении инсулина необходимо прежде всего инактивировать протеолитические энзимы поджелудочной железы.

Как правило, процессы очистки большинства белков не удается завершить в течение одного рабочего дня. Поэтому возникает необходимость кратковременного хранения (до 1 — 2 недель) промежуточных препаратов. Лучше всего хранить их в замороженном состоянии — при — 10ч — 20° и ниже. Следует, однако, учитывать, что сам процесс замораживания ведет к неравномерному распределению влаги, солей и белка в замороженной массе, что не всегда безразлично для состояния белка. В частности, при замораживании происходит распад некоторых липопротеинов. Для многих белков вполне возможно кратковременное хранение при 0:+4°. При этом лучше сохраняются концентрированные белковые растворы и осадки с высоким содержанием нейтральных солей (хлориды, сульфаты, ацетаты, фосфаты и карбонаты натрия, калия и аммония).

При необходимости длительного хранения промежуточных или конечных продуктов очистки белков рекомендуется высушивание их под вакуумом из замороженного состояния — так называемая лиофилизация. В настоящее время существует много приемов и различных приборов для лиофилнзации, описание которых выходит за рамки настоящего руководства. Следует лишь отметить, что остаточная влажность после высушивания не должна превышать 3—4% (наилучшее значение около 1—2%). Такие препараты выдерживают многомесячное и даже многолетнее хранение при отрицательной температуре.

В отдельных случаях возможно высушивание белковых препаратов и более простыми способами. Так, например, белковые осадки трипсина и химотрипсина можно высушивать в вакуум-эксикаторе над поглотителем влаги (хлористым кальцием и др.). Гистоны и некоторые другие белки, хорошо выдерживающие обработку органическими растворителями, обезвоживают ацетоном, а последний удаляют под вакуумом.

Особой задачей, общей для самых различных методов и стадий очистки белков, является концентрирование белковых растворов. В тех случаях, когда имеется щадящий метод осаждения белка, применяемый на данной стадии очистки, концентрирование сводится к осаждению с последующим растворением осадка в меньшем объеме. Если же осаждение почему-либо нежелательно, приходится прибегать к различным по сложности методам. Небольшие объемы белковых растворов удобно концентрировать, помещая в целлофановую гильзу, обдуваемую воздухом с помощью вентилятора. Хорошие результаты достигаются также при диализе растворов белка против концентрированных растворов или суспензий таких полимеров, как поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и некоторые смолы, применяемые для хроматографии. Концентрирование выпариванием под вакуумом допустимо лишь в условиях, исключающих вспенивание. Если в распоряжении исследователя имеется достаточно производительная установка для лиофилнзации, то можно высушить препарат из замороженного состояния под вакуумом до любых значений остаточной влажности.

Значительное концентрирование без денатурации достигается также и с помощью ультрафильтрации.

Применительно к высокоустойчивым белкам используют иногда и более грубые приемы концентрирования (например, выпаривание растворов при повышенных температурах без вакуума).