Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Определение величины и формы белковых молекул
Аналитическое ультрацентрифугирование

Впервые идея о применении значительной центробежной силы для осаждения и определения размеров коллоидных частиц была высказана и опробована на практике еще в 1913 г. Думанским. Однако потребовались долгие годы теоретических и практических изысканий, прежде чем Сведбергом (1940 г.) были разработаны теоретические основы данного метода и создана первая ультрацентрифуга со скоростью вращения ротора до 65 000 об/мин. К настоящему времени методы аналитического и препаративного ультрацентрифугирования получили широкое применение в исследованиях белков и нуклеиновых кислот и при изучении структурных элементов клетки.

Ультрацентрифугами называются установки, в которых ротор вращается со скоростью порядка 50 000—60 000 об/мин и достигаются ускорения порядка 250 000—300 000 g. По способу приведения ротора во вращение современные центрифуги делятся на воздушные и электрические; масляные центрифуги в настоящее время уже не выпускаются. Ротор аналитической центрифуги (рис. 37) имеет два отверстия: одно для рабочей ячейки, другое — для балансировочной. Ячейка аналитической ультрацентрифуги представляет собой полый цилиндр из алюминиевого сплава; внутри цилиндра имеется алюминиевая или пластмассовая вставка, полость которой закрывается с двух сторон кварцевыми стеклами. В сечении полость вставки представляет собой равнобедренную трапецию, стороны которой совпадают с радиусами окружности вращения ротора (рис. 38). Такую форму придают для предотвращения конвекции в растворе за счет оседания частиц на стенки рабочей полости ячейки. Исследуемый раствор вносят через отверстие, находящееся в верхней части ячейки. Объем ячейки — порядка 0,8 мл. При заполнении ячейки исследуемым раствором в ее рабочем пространстве остается небольшой пузырек воздуха.

Рис. 37. Стандартная ячейка в собранном и разобраном виде и аналитический ротор ультрацентрифуги «Спинко».

Рис. 38. Схематическое изображение ячейки ультрацентрифуги (Steiner, 1965).

Для наблюдения за процессом седиментации и регистрации границы оседания в аналитических центрифугах применяются различные оптические системы Принципы регистрации этих систем основаны либо на определении изменения степени абсорбции (поглощения) света, либо на определении изменения показателя преломления в различных местах ячейки во время опыта

При центрифугировании под действием центробежных сил между слоем воздуха и раствором образуется граница, называемая мениском Вместе с тем происходит седиментация растворенных веществ, в результате чего образуется граница раздела между чистым растворителем и раствором белка, которая постепенно смещается ко дну ячейки Поскольку всегда происходит диффузия высокомолекулярных частиц из раствора в растворитель, то граница раздела не представляет собой плоскости, а всегда несколько размыта Естественно, что степень поглощения света при переходе от растворителя к раствору будет меняться хотя и круто, но постепенно, равно как и изменение концентрации седиментирующих молекул Если через такую систему пропустить ультрафиолетовый свет, то это изменение концентрации может выразиться в неодинаковом почернении фотопленки по длине ячейки В месте границы раздела будет происходить изменение степени почернения пленки от максимального для непоглощающего растворителя до минимального для поглощающего раствора (рис 39, а) Определяя степень почернения путем микрофотомегрирования, можно получить кривую распределения концентрации седиментирующего белка Проведя такие измерения через определенные промежутки времени седиментации, можно получить кривую распределения концентрации вдоль радиуса ячейки При этом обработка фотопленок, при использовании абсорбционных оптических систем, позволяет сразу получить интегральные кривые седиментации (рис 39, б) Абсорбционные системы, снабженные кварцевой оптикой, используются чаще всего для исследования разбавленных растворов нуклеиновых кислот и их производных.

Аналогично постепенному изменению концентрации на размытой границе раздела происходит постепенное изменение и показателя преломления Это постепенное изменение показателя преломления носит название градиента показателя преломления, или градиента рефракции Очевидно, что наибольшее значение градиента рефракции приходится на середину зоны раздела, т е на тот участок, где должна была бы пройти идеальная граница раздела Именно здесь изменение показателя преломления па единицу длины оказывается наибольшим, причем эта максимальная величина градиента рефракции соответствует максимальным значениям градиента концентрации в зоне раздела Таким образом, кривая градиента рефракции имеет вид пика Для регистрации границы седиментации по градиенту рефракции используется так называемый метод скрещенных диафрагм, или метод Фильпота—Свенсона («теневой» метод). Подробнее этот метод описан ниже (гл. VII) в связи с изложением теории свободного электрофореза белков. Оптическая система позволяет в этом случае сразу же наблюдать визуально дифференциальные кривые градиента концентрации (рефракции) на седиментационных диаграммах и регистрировать их на фотопластинках (рис. 40). Последовательное фотографирование через определенные промежутки времени седиментации позволяет измерить скорости перемещения пиков кривых во время опыта.

Рис 39 Седиментационные диаграммы, полученные методом абсорбции ультрафиолетового света (а), и их схемы (б) для пяти последовательных моментов опыта (Schachman, 1959)

Рис 40. Седиментационные диаграммы (а), полученные методом скрещенных диафрагм, и их схемы (б) для пяти последовательных моментов опыта (Schachman, 1959).

При аналитическом центрифугировании используются в основном два метода: метод скорости седиментации и метод седиментационного равновесия.