БИОХИМИЯ УЧЕБНИК ДЛЯ ВУЗОВ - Е. С. Северина - 2004

РАЗДЕЛ 5. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ

III. Перенос веществ через мембраны

Любая молекула может пройти через липидный бислой, однако скорость пассивной диффузии веществ, т. е. перехода вещества из области с большей концентрацией в область с меньшей, может сильно отличаться. Для некоторых молекул это занимает столь длительное время, что можно говорить об их практической непроницаемости для липидного бислоя мембраны. Скорость диффузии веществ через мембрану зависит главным образом от размера молекул и их относительной растворимости в жирах.

Легче всего проходят простой диффузией через липидную мембрану малые неполярные молекулы, такие как O₂, стероиды, тиреоидные гормоны, а также жирные кислоты. Малые полярные незаряженные молекулы — СO₂, NH₃, Н₂O, этанол, мочевина — также диффундируют с достаточно большой скоростью. Диффузия глицерола идёт значительно медленнее, а глюкоза практически не способна самостоятельно пройти через мембрану. Для всех заряженных молекул, независимо от размера, липидная мембрана непроницаема.

Транспорт таких молекул возможен благодаря наличию в мембранах либо белков, формирующих в липидном слое каналы (поры), заполненные водой, через которые могут проходить вещества определённого размера простой диффузией, либо специфических белков-переносчиков, которые избирательно взаимодействуя с определёнными лигандами, облегчают их перенос через мембрану (облегчённая диффузия).

Кроме пассивного транспорта веществ, в клетках есть белки, активно перекачивающие определённые растворённые в воде вещества против их градиента, т. е. из меньшей концентрации в область большей. Этот процесс, называемый активным транспортом, осуществляется всегда с помощью белков-переносчиков и происходит с затратой энергии.

А. Строение и функционирование белковых каналов

Каналы в мембране формируются интегральными белками, которые «прерывают» липидный бислой, образуя пору, заполненную водой. Стенки канала «выстилаются» радикалами аминокислот этих белков.

Если каналы различают вещества только по размеру и пропускают все молекулы меньше определённой величины, по градиенту концентрации, т. е. служат фильтрами, то их называют «неселективные каналы», или «поры». Такие поры есть в наружной мембране митохондрий, где молекулы белка-порина образуют широкие гидрофильные каналы. Через них могут проходить все молекулы с молекулярной массой 10 кД и меньше, в том числе и небольшие белки.

Селективные каналы, как правило, участвуют в переносе определённых ионов. Ионная селективность (избирательность) каналов определяется их диаметром и строением внутренней поверхности канала. Например, катионселективные каналы пропускают только катионы, так как содержат много отрицательно заряженных аминокислотных остатков.

Открытие или закрытие селективных каналов регулируется либо изменением концентрации специфических регуляторов, таких как медиаторы, гормоны, циклические нуклеотиды, NO, G-белки, либо изменением трансмембранного электрохимического потенциала (рис. 5-14). Воздействие регуляторного фактора вызывает конформационные изменения каналообразующих белков, канал открывается и ионы проходят по градиенту концентрации. Транспорт веществ через каналы не приводит к конформационным изменениям белков и зависит только от разности концентраций веществ по обе стороны мембраны. Поэтому скорость транспорта веществ через такие каналы может достигать 10⁶-10⁸ ионов в секунду.

Рис. 5-14. Регулируемый канал. Заштрихованные квадраты — регуляторы, светлые кружки— переносимые ионы.

Б. Облегченная диффузия веществ

В мембранах клеток существуют белки-транслоказы. Взаимодействуя со специфическим лигандом, они обеспечивают его диффузию (транспорт из области большей концентрации в область меньшей) через мембрану. В отличие от белковых каналов, транслоказы в процессе взаимодействия с лигандом и переноса его через мембрану претерпевают конформационные изменения. Кинетически перенос веществ облегчённой диффузией напоминает ферментативную реакцию. Для транслоказ существует насыщающая концентрация лиганда, при которой все центры связывания белка с лигандом заняты, и белки работают с максимальной скоростью V_mах. Поэтому скорость транспорта веществ облегчённой диффузией зависит не только от градиента концентраций переносимого лиганда, но и от количества белков-переносчиков в мембране.

Существуют транслоказы, переносящие только одно растворимое в воде вещество с одной стороны мембраны на другую. Такой простой транспорт называют «пассивный унипорт». Примером унипорта может служить функционирование ГЛЮТ-1 — транслоказы, переносящей глюкозу через мембрану эритроцита (рис. 5-15):

Рис. 5-15. Облегчённая диффузия (унипорт) глюкозы в эритроциты с помощью ГЛЮТ-1 (S — молекула глюкозы). Молекула глюкозы связывается переносчиком на наружной поверхности плазматической мембраны. Происходит конформационное изменение, и центр переносчика, занятый глюкозой, оказывается открытым внутрь клетки. Вследствие конформационных изменений переносчик теряет сродство к глюкозе, и молекула высвобождается в цитозоль клетки. Отделение глюкозы от переносчика вызывает конформационные изменения белка, и он возвращается к исходной конформации.

Некоторые транслоказы могут переносить два разных вещества по градиенту концентраций в одном направлении — пассивный симпорт, или в противоположных направлениях — пассивный антипорт (рис. 5-16).

Рис. 5-16. Типы (виды) облегчённой диффузии с участием переносчиков (транслоказ). S₁, S₂ — разные молекулы.

Примером транслоказы, работающей по механизму пассивного антипорта, может служить анионный переносчик мембраны эритроцитов (рис. 5-17).

Рис. 5-17. Пассивный антипорт анионов НСO_3- и Сl^- через мембрану эритроцитов. А - когда эритроцит находится в венозных капиллярах, анион НСO_3-, образованный при диссоциации угольной кислоты, по градиенту концентрации выходит в кровь. В обмен на каждый транспортируемый из клетки ион НСO₃^- транслоказа переносит в эритроцит ион Сl^-; Б - когда кровь достигает лёгких транслоказа производит обмен ионами в противоположных направлениях. Такая «челночная» система работает очень быстро и обеспечивает удаление СO₂ из организма и в то же время сохранение оптимального значения pH в клетке.

Внутренняя митохондриальная мембрана содержит много транслоказ, осуществляющих пассивный антипорт (рис. 5-18). В процессе такого переноса происходит эквивалентный обмен ионами, но не всегда эквивалентный обмен по заряду.

Рис. 5-18. Некоторые митохондриальные переносчики.

В. Строение и функционирование белков-переносчиков, осуществляющих активный транспорт

Перенос некоторых лигандов (ионов, глюкозы, аминокислот) через мембраны происходит против градиента концентрации и сопряжён с затратой энергии (активныйтранспорт). Перенос лигандов через мембрану, связанный с затратой энергии АТФ, называют «первично-активный транспорт».

1. Первично-активный транспорт

Перенос некоторых неорганических ионов идёт против градиента концентрации при участии транспортных АТФ-аз (ионных насосов). Все ионные насосы одновременно служат ферментами, способными к аутофосфорилированию и аутодефосфорилированию. АТФ-азы различаются по ионной специфичности, количеству переносимых ионов, направлению транспорта. В результате функционирования АТФ-азы переносимые ионы накапливаются с одной стороны мембраны. Наиболее распространены в плазматической мембране клеток человека Na⁺, К⁺-АТФ-аза, Са²⁺-АТФ-аза и Н⁺, К⁺-АТФ- аза слизистой оболочки желудка.

Na⁺, К⁺-АТФ-аза

Этот фермент-переносчик катализирует АТФ- зависимый транспорт ионов и К⁺ через плазматическую мембрану. Na⁺, К⁺ -АТФ-аза состоит из субъединиц α и β; α — каталитическая большая субъединица, αβ — малая субъединица (гликопротеин). Активная форма трансло- казы — тетрамер (αβ)₂ (рис. 5-19).

Рис. 5-19. Строение и функционирование Nа⁺, К⁺-АТФ-азы плазматической мембраны. 1 - три иона натрия связываются специфическим центром транслоказы; 2 - изменение конформации транслоказы, вызванное присоединением 3Nа⁺, приводит к активации каталитической субъединицы и увеличению сродства активного центра к субстрату (АТФ). Протекает реакция аутофосфорилирования по карбоксильной группе аспарагиновой кислоты; 3 - аутофосфорилирование изменяет заряд и конформацию транслоказы, она закрывается с внутренней стороны мембраны и открывается с наружной, уменьшается сродство к ионам натрия и они диссоциируют от переносчика; 4 - Nа⁺, К⁺-АТФ-аза открытая с наружной стороны мембраны имеет специфический центр связывания для 2К⁺; Присоединение двух ионов калия к фосфорилированной транслоказе вызывает изменение конформации и появление аутофосфатазной активности. Протекает реакция аутодефосфорилирования; 5 - дефосфорилирование изменяет заряд и конформацию транслоказы, она закрывается с наружной стороны мембраны и открывается с внутренней, уменьшается сродство к ионам калия, и они диссоциируют от Nа⁺, К⁺-АТФ-азы; 6 - АТФ-аза возвращается в первоначальное состояние.

Na⁺, К-АТФ-аза отвечает за поддержание высокой концентрации К⁺ в клетке и низкой концентрации Na⁺. Так как Nа⁺, К⁺-АТФ-аза выкачивает три положительно заряженных иона, а закачивает два, то на мембране возникает электрический потенциал с отрицательным значением на внутренней части клетки по отношению к её наружной поверхности.

Са²⁺-АТФ-аза

В цитозоле «покоящихся» клеток концентрация Са²⁺ составляет ~10^-7 моль/л, тогда как вне клетки она равна ~2 • 10^-3 моль/л. Поддерживает такую разницу в концентрации система активного транспорта ионов кальция; её основные компоненты — кальциевые насосы — Са²⁺- АТФ-азы и Na⁺, Са²⁺ -обменники.

Са²⁺-АТФ-аза локализована не только в плазматической мембране, но и в мембране ЭР. Фермент состоит из десяти трансмембранных доменов, пронизывающих клеточную мембрану. Между вторым и третьим доменами находятся несколько остатков аспарагиновой кислоты, участвующих в связывании кальция. Область между четвёртым и пятым доменами имеет центр для присоединения АТФ и аутофосфорилирования по остатку аспарагиновой кислоты. Са²⁺- АТФ-азы плазматических мембран некоторых клеток регулируются белком кальмодулином. Каждая из Са²⁺-АТФ-аз плазматической мембраны и ЭР представлена несколькими изоформами.

Работа Са²⁺-АТФ-азы цитоплазматической мембраны по стадиям представлена на рис. 5-20.

Рис. 5-20. Последовательность событий в процессе работы Са²⁺-АТФ-азы. 1 - связывание двух ионов кальция участком АТФ-азы, обращённой в цитозоль; 2 - изменение заряда и конформации фермента (АТФ-азы), вызванное присоединением двух ионов Са²⁺, приводит к повышению сродства к АТФ и активации аутофосфорилирования; 3 - аутофосфорилирование сопровождается конформационными изменениями, АТФ-аза закрывается с внутренней стороны мембраны и открывается с наружной; 4 - происходит снижение сродства центров связывания к ионам кальция и они отделяются от АТФ-азы; 5 - аутодефосфорилирование активируется ионами магния, в результате Са²⁺-АТФ-аза теряет фосфорный остаток и два иона Мg²⁺; 6 - АТФ-аза возвращается в исходное состояние.

Нарушение активности Са²⁺-АГФ-азы при патологии. Одна из причин нарушения работы Са²⁺-АТФ-азы — активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран. Окислению подвергаются как ацильные остатки жирных кислот в составе фосфолипидов, так и SН-группы в активном центре фермента. Нарушение структуры липидного окружения и структуры активного центра приводит к изменению конформации АТФ-азы, потере сродства к ионам кальция и способности к аутофосфорилированию. АТФ-аза перестаёт выкачивать ионы кальция из цитозоля клетки, повышается концентрация внутриклеточного кальция, Са²⁺ усиливает мышечное сокращение, возрастает тонус мышечной стенки, что приводит к повышению АД. Не последнюю роль нарушение функционирования Са²⁺-АТФ-азы играет в развитии атеросклероза, рака, иммунных патологий.

2. Вторично-активный транспорт

Перенос некоторых растворимых веществ против градиента концентрации зависит от одновременного или последовательного переноса другого вещества по градиенту концентрации в том же направлении (активный симпорт) или в противоположном (активный антипорт). В клетках человека ионом, перенос которого происходит по градиенту концентрации, чаще всего служит Na⁺.

Примером такого типа транспорта может служить Na⁺, Са²⁺-обменник плазматической мембраны (активный антипорт), ионы натрия по градиенту концентрации переносятся в клетку, а ионы Са²⁺ против градиента концентрации выходят из клетки (рис. 5-21).

Рис. 5-21. Натрий-зависимый транспорт ионов кальция. А - Nа⁺-зависимый переносчик ионов кальция; Б - Na⁺, К⁺-АТФ-аза.

По механизму активного симпорта происходят всасывание глюкозы клетками кишечника и реабсорбция из первичной мочи глюкозы, аминокислот клетками почек (рис. 5-22).

Рис. 5-22 Механизм активного симпорта. А - Nа⁺ и глюкоза связываются в разных центрах транслоказы. Ионы стремятся войти в клетку по градиенту концентрации и «тащат» глюкозу за собой, если концентрация Nа⁺ вне клетки уменьшается, транспорт глюкозы в клетки снижается; Б - ионы натрия, проникающие в клетку вместе с глюкозой, «выкачиваются» обратно Nа⁺, К⁺-АТФ-азой, поддерживающей градиент концентрации Nа⁺ и контролирующей транспорт глюкозы.

Г. Перенос через мембрану макромолекул и частиц: эндоцитоз и экзоцитоз

Траспортные белки обеспечивают перемещение через клеточную мембрану полярных молекул небольшого размера, но они не могут транспортировать макромолекулы, например, белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды или ещё более крупные частицы. Механизмы, с помощью которых клетки могут усваивать такие вещества или удалять их из клетки, отличаются от механизмов транспорта ионов и полярных соединений.

Эндоцитоз

Перенос вещества из среды в клетку вместе с частью плазматической мембраны называют «эндоцитоз». Путём эндоцитоза (фагоцитоза) клетки могут поглощать большие частицы, такие как вирусы, бактерии или обломки клеток. Захват больших частиц осуществляется в основном специализированными клетками — фагоцитами.

Поглощение жидкости и растворённых в ней веществ с помощью небольших пузырьков называют «пиноцитоз». Усвоение веществ механизмом эндоцитоза (пиноцитоза)характерно для всех клеток.

Цикл эндоцитоза начинается в определённых участках плазматической мембраны, называемых «окаймлённые ямки» (рис. 5-23). На долю окаймлённых ямок приходится всего 1— 2% общей площади мембраны. Белок клатрин образует решётчатые структуры, связанные с углублениями на поверхности плазматической мембраны.

Рис. 5-23. Последовательность событий при образовании окаймлённого пузырька из окаймлённой ямки.

Окаймлённые ямки втягиваются в клетку, сужаются у основания, отделяются от мембраны, образуя окаймлённые пузырьки (пиноцитозные пузырьки). Время жизни окаймлённых ямок невелико, они формируются в течение минуты, затем совершают цикл эндоцитоза.

Вещества в составе пиноцитозных пузырьков не смешиваются с другими макромолекулами клетки. Они заканчивают свой путь в лизосомах, а мембранные компоненты пузырьков, содержащие клатрин, возвращаются в плазматическую мембрану.

Эндоцитоз, происходящий с участием рецепторов, встроенных в окаймлённые ямки, позволяет клеткам поглощать специфические вещества. Макромолекулы или частицы связываются рецепторами и накапливаются в окаймлённой ямке. Затем следует погружение в клетку и отделение эндоцитозного пузырька, в составе которого находится поглощённое вещество, мембранные компоненты окаймлённой ямки и рецептор. В разные окаймлённые ямки могуг быть встроены разные рецепторы.

Примером рецептор-зависимого эндоцитоза может служить поступление в клетку холестерола в составе липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) (рис. 5-24).

Рис. 5-24. Положение рецепторов ЛПНП в цитоплазматической мембране. А - положение рецепторов ЛПНП в окаймлённой ямке; Б - положение дефектных рецепторов ЛПНП вне окаймлённой ямки.

Количество рецепторов в окаймлённой ямке плазматической мембраны варьирует в зависимости от потребности клетки в холестероле. Нарушение структуры рецепторов ЛПНП (мутации в гене) не позволяет им встраиваться в плазматическую мембрану в область окаймлённой ямки. Положение рецептора вне окаймлённой ямки не снижает его комплементарность к ЛПНП, но эндоцитоз комплекса рецептор- ЛПНП не происходит.

Экзоцитоз

Макромолекулы, например, белки плазмы крови, пептидные гормоны, пищеварительные ферменты, белки внеклеточного матрикса, липопротеиновые комплексы, синтезируются в клетках и затем секретируются в межклеточное пространство или кровь. Но мембрана непроницаема для таких макромолекул или комплексов, их секреция происходит путём экзоцитоза. Особенность экзоцитоза в том, что секретируемые вещества локализуются в пузырьках и не смешиваются с другими макромолекулами или органеллами клетки. В ходе экзоцитоза содержимое секреторных пузырьков выделяется во внеклеточное пространство, когда они сливаются с плазматической мембраной.

В организме имеются как регулируемый, так и нерегулируемый пути экзоцитоза. Нерегулируемая секреция характеризуется непрерывным синтезом секретируемых белков, упаковкой их в транспортные пузырьки в аппарате Гольджи и переносом к плазматической мембране для секреции. Примером может служить синтез и секреция коллагена фибробластами для формирования межклеточного матрикса.

Для регулируемой секреции характерны хранение приготовленных на экспорт молекул в транспортных пузырьках и их слияние с плазматической мембраной только при воздействии на клетку специфического стимула. С помощью регулируемой секреции происходят выделение пищеварительных ферментов в период переваривания пищи, а также секреция гормонов, нейромедиаторов и других биологически активных веществ. Пример такого типа секреции — выброс пептидного гормона инсулина в кровь после еды. Стимулом к секреции инсулина, хранящегося в секреторных гранулах β-клеток островков Лангерханса поджелудочной железы, является повышение концентрации глюкозы в крови и β-клетках (рис.5-25).

Рис. 5-25. Регуляция секреции инсулина. Повышение концентрации глюкозы приводит к увеличению соотношения АТФ/АДФ в β-клетке, закрытию АТФ-зависимых калиевых каналов, деполяризации, раскрытию потенциалзависимых кальциевых каналов. Повышение концентрации ионов калия и кальция в β-клетке инициирует слияние секреторных пузырьков (инсулинсодержащих гранул) с мембраной и выделение содержимого пузырьков (инсулина) из клетки.