Биотехнология - Ю.О. Сазыкин 2006

Общая биотехнология
Молекулярные механизмы внутриклеточной регуляции и их использование в биотехнологическом производстве
Молекулярные механизмы защиты продуцентов от веществ с «суицидным эффектом»

Биотехнологам, создающим суперпродуценты биологически активных веществ, как правило, приходится сталкиваться с проблемой зашиты продуцента от вырабатываемого в большом количестве целевого продукта. Особенно наглядно это демонстрируется при создании суперпродуцентов вторичных микробных метаболитов. С одной стороны, образуемые в почвенных биоценозах микробные метаболиты нередко выполняют функцию «оружия в борьбе за существование». С другой стороны, за счет мутаций, клеточной и генной инженерии, а также подбора специальных питательных сред такие вещества начинают вырабатываться клеткой в неестественно больших для нее количествах.

С позиций биотехнологии проблему защиты продуцентов от образуемых ими веществ нельзя рассматривать только применительно к антибиотикам. Однако последние являются наиболее показательным примером зашиты клетки от потенциально «суицидных» собственных веществ, способных вызывать ее гибель. Механизмы защиты продуцента от собственной сверхпродуктивности могут быть разными.

В случае антибиотиков таких механизмов несколько. Родь каждого механизма защиты зависит в свою очередь от механизма биологической активности конкретного антибиотика. Известно, что наиболее распространенную группу антибиотиков, применяемых в клинике, если не считать беталактамов, составляют ингибиторы синтеза белка у бактерий на рибосомном уровне: тетрациклины, аминогликозиды, макролиды и некоторые другие. Их продуцентами являются актиномицеты, т.е. многоклеточные бактерии, способность которых выдерживать высокие концентрации собственных антибиотиков объясняется несколькими причинами. Из них главной является особенность биосинтеза их молекул (точнее сборка углеродного скелета), который происходит особенно интенсивно и достигает максимума, когда культура продуцента замедляет скорость размножения своих клеток и переходит из трофо- в идиофазу. Иными словами, несмотря на потенциальную способность тормозить синтез белка, накопившийся антибиотик не способен причинить вред своим клеткам, в которых синтез белка уже почти прекратился.

Другие причины, наблюдаемые на примере некоторых групп антибиотиков — ингибиторов белкового синтеза, носят более частный характер. Исследования с антибиотиками — аминогликозидами на примере наиболее подробно изученного неомицина (продуцент Actinomyces fridae) показали, что в процессе или после сборки молекулы антибиотика он подвергается временной обратимой инактивации.

Рибосомы продуцента неомицина, как показывают опыты с бесклеточной синтезирующей белок системой, чувствительны к антибиотику. Соответственно возникает вопрос о совмещении в одной и той же клетке эндогенного ингибитора (каковым в данном случае является неомицин) с работающими рибосомами. Частично ответить на этот вопрос можно, исходя из вышеуказанной общефизиологической закономерности, характеризующей биосинтез антибиотиков: максимум биосинтеза антибиотика не совпадает по времени с максимальной скоростью синтеза белка (цикл развития культуры уже завершен).

Существует и специфический механизм защиты клетки продуцента от неомицина, который может быть обратимо инактивирован за счет фосфорилирования одной из многочисленных в аминогликозидной структуре амино- или гидроксильных групп. Источником переносимого на антибиотик фосфатного остатка является АТФ. Обратимость инактивации обусловлена существованием в клетке продуцента локализованной в клеточной мембране щелочной фосфатазы. Этот фермент на последнем этапе выброса антибиотика в среду осуществляет его реактивацию, т.е. дефосфорилирование, после которого антибиотик уже в активном состоянии направляется в среду в силу односторонней проницаемости мембраны.

Причем иногда реактивирующий фермент не справляется со своими функциями, и в среду антибиотик выделяется в неактивном виде. Если его сконцентрировать и обработать щелочной фосфатазой, можно получить дополнительное количество антибиотика из, казалось бы, неактивной культуральной жидкости.

Небезынтересно, что ген фосфорилирующего фермента находится в кластере генов биосинтеза неомицина, наглядно демонстрируя генетическую близость защитной аминогликозид-фосфотрансферазы у продуцента с ферментами биосинтеза аминогликозида, т.е. подчинение функций генов кластера единой цели — образованию антибиотика, эффективного против микроорганизмов-конкурентов, но безвредного для своего продуцента.

Однако помимо выполнения защитной функции фосфотрансфераза может воздействовать и на фрагменты собираемой аминогликозидной молекулы, активируя их, т.е. выполнять двойную функцию (при биосинтезе — как фактор защиты от суицидного агента). Кроме фосфорилирования-дефосфорилирования существуют и другие механизмы инактивации-реактивации аминогликозидов, например ацетилирование-деацетилирование.

Защита от собственных антибиотиков у актиномицетов — продуцентов макролидных структур (прежде всего эритромицина) обусловлена наличием в клетке специфической метилазы, метилирующей определенный адениновый остаток в 23 S рибосомальной РНК. В результате 50 S субъединица рибосомы продуцента эритромицина имеет конфигурацию, при которой реагирование антибиотика с пептидилтрансферазным центром рибосомы, как это происходит в случае эубактерий, невозможно. Иными словами, белковый синтез у продуцента специфически защищен от собственного антибиотика и помимо неспецифической защиты на физиологическом уровне.

Механизмы защиты клетки у продуцентов тетрациклинов изучены мало. Проводить аналогию с изученными механизмами тетрациклинорезистентности у патогенных бактерий довольно трудно.

Для характеристики системы защиты продуцента от некоторых циклопептидных мембранотропных антибиотиков (например, грамицидина С) используется термин «компартментация». Место биосинтеза этого антибиотика изолировано от чувствительных к нему метаболических реакций продуцирующей его клетки. Молекула антибиотика (ее углеродный скелет) собирается в мультиферментных комплексах, обеспечивающих упорядоченную последовательность реакций сборки. Взаиморасположение ферментов в комплексе координируется за счет дисульфидных и водородных связей. Мультиферментные комплексы локализуются на периферии клетки продуцента. Также компартментация играет роль в защите клеток продуцентов (как правило, это актиномицеты) в случае образования ими ДНК-тропных антибиотиков (последние применяются в онкологической клинике). В то же время антибиотики семейства рифамицинов, ингибируя синтез РНК в клетках путем взаимодействия с РНК полимеразой, не действуют на синтез РНК в клетке своего собственного продуцента.

Интересно, что проблема защиты продуцента от потенциального суицидного агента отсутствует в случае продуцента пенициллина Penicillium chrysogeniim даже при повышении продуктивности штамма гриба во много тысяч раз. Пенициллин проявляет антимикробный эффект, подавляя синтез пептидогликана клеточной стенки бактерий. У грибов пептидогликана как полимера клеточной стенки нет. Соответственно у них нет и фермента синтеза пептидогликана — D-аланин-транспептидазы, который является мишенью действия пенициллина при его контакте с бактериальной клеткой.

Контрольные вопросы

1. Каково влияние механизма ретроингибирования на выход конечных продуктов биосинтеза лекарственных средств?

2. Как влияет изменение содержания источников углерода, азота и фосфора в питательной среде на биосинтез антибиотиков?

3. Каковы механизмы регуляции экспрессии генов и их использование в биотехнологических процессах?

4. Какова роль системы регуляции метаболизма, обусловленной гуанозин-тетрафосфатом в биосинтезе целевых продуктов?

5. Какую роль играет катаболитная репрессия в биосинтезе лекарственных средств?

6. Что представляют собой мутанты с измененной регуляцией азотного метаболизма и каковы возможности интенсификации биосинтеза ряда первичных, вторичных метаболитов и некоторых ферментов?

7. Что такое системы внутриклеточного транспорта и секреции биотехнологических продуктов у микроорганизмов?

8. Каковы механизмы защиты клетки, если она является «суперпродуцентом»?

9. Как можно сохранить активность промышленных штаммов микроорганизмов?

10. Как переносится вещество через мембраны клетки?