Биотехнология - Ю.О. Сазыкин 2006

Частная биотехнология
Лекарственные препараты, получаемые в фармацевтической промышленности биотехнологическими методами
Ферменты

Ферменты или энзимы (fermentum — «закваска», enzyme — «в дрожжах») — высокомолекулярные соединения белковой природы, являющиеся катализаторами биохимических реакций в живых организмах и вне их. К настоящему времени найдена лишь одна ферментативная реакция небелковой природы, когда молекула РНК катализирует собственное «разрезание» на части.

В живой клетке присутствует множество разнообразных соединений, но реакции между ними не беспорядочны, а образуют строго определенные метаболические пути, характерные для данной клетки. Индивидуальность клетки в большой степени определяется уникальным набором ферментов, который она генетически запрограммирована производить. Отсутствие даже одного фермента или какой-нибудь его дефект могут иметь очень серьезные отрицательные последствия для организма.

Все ферменты относятся к глобулярным белкам, причем каждый фермент выполняет специфическую функцию, связанную с присущей ему глобулярной структурой. Однако активность многих ферментов с большой молекулярной массой — от 10 кДа до 1 МДа и более (для сравнения: молекулярная масса глюкозы 180, диоксида углерода 44, аминокислот от 75 до 204) зависит от небелковых низкомолекулярных соединений, называемых кофакторами.

Молекулярный комплекс белковой части (апофермента) и кофактора называется холоферментом. Роль кофактора могут выполнять ионы металлов (Zn²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺ Fe²⁺, Cu²⁺, K⁺, Na⁺) или сложные органические соединения. Органические кофакторы обычно называют коферментами, некоторые из которых являются производными витаминов. Связи между ферментом и коферментом могут быть разными. Иногда они существуют отдельно и связываются только во время реакции. В других случаях кофактор и фермент связаны постоянно и иногда прочными ковалентными связями (тогда небелковую часть фермента называют простети- ческой группой). Важнейшими коферментами являются производные витаминов, кофакторами — минералы (макро- и микроэлементы). При дефиците витаминов и минералов активность ферментативных реакций резко падает, с чем связаны многие патологические процессы в организме.

Ферменты делятся на простые и сложные. Простые состоят только из аминокислот, а сложные (их большинство) помимо белка включают небелковую группу (кофактор или кофермент).

Особенностью ферментов является их исключительно высокая активность (они ускоряют реакции в миллиарды раз). Так, одна единственная молекула фермента может катализировать при обычной температуре превращение от тысячи до миллиона молекул вещества в минуту. Эта скорость катализа недостижима для небиологических катализаторов. Другое, не менее важное, свойство ферментов — специфичность (избирательность) их действия в отношении структуры субстрата, типа реакций и условий ее проведения.

Ферменты, обладая высокой специфичностью, направляют превращение вещества в строгое русло. Они катализируют реакции в мягких условиях, т.е. при обычном давлении, небольшой температуре и значениях pH, близких к нейтральным, весьма чувствительны к сдвигам pH среды и изменению температуры. Так как максимальная активность фермента обусловлена оптимальной конформацией молекулы фермента в целом и активного центра в частности, то даже небольшие изменения окружающих условий, которые затрагивают связывание субстрата или конформацию третичной структуры белка, будут соответственно влиять на скорость ферментативной реакции.

Оптимальное pH для каждого фермента означает, что состояние его ионизации соответствует наилучшей комплементарности. Изменение температуры вызывает противоречивый эффект: с одной стороны, при повышении температуры до 37—40 °С скорость ферментативной реакции увеличивается, что закономерно для катализа; с другой стороны, при температуре более 50 °С начинается денатурация фермента. Ферментативные процессы не дают побочных реакций, для них характерен 100%-Й выход целевого продукта.

Ферменты регулируемы, т.е. могут изменять свою активность под воздействием ряда факторов, при этом выход целевого продукта будет разным. Этим обеспечивается скоординированность всех метаболических процессов во времени.

Скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству фермента, поэтому недостаток фермента в организме означает низкую скорость превращения какого-либо соединения, и наоборот, одним из путей приспособления организма к изменениям внешней среды является увеличение количества требуемого фермента.

Известно более 6 000 ферментов, многие из которых катализируют только одну реакцию; 150 из них выделены в кристаллическом виде.

Энзимы классифицируются не как индивидуальные вещества, а как катализаторы определенных химических превращений или групп химических превращений, в соответствии с этим их подразделяют на шесть основных классов:

✵ оксидоредуктазы — катализаторы окислительно-востановительных реакций;

✵ трансферазы — реакции переноса отдельных групп с одной молекулы на другую;

✵ гидролазы — гидролитическое расщепление связей (с участием воды);

✵ лиазы (синтазы) — реакции соединения или расщепления молекул (присоединения-отсоединения воды, аммиака, диоксида углерода и т.д.);

✵ изомеразы — взаимопревращение изомеров (изменение строения внутри одной молекулы);

✵ лигазы (синтетазы) — образование связей в реакции конденсации двух разных соединений с участием энергии АТФ.

Осознание ключевой роли ферментов во всех клеточных процессах привело к широкому их применению в разных отраслях, в том числе при производстве лекарственных средств, а также в медицинской практике в качестве лечебных и диагностических препаратов.

В настоящее время четко определились три основных направления исследований в области медицинской энзимологии: энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия.

Энзимопатология. Как известно, из более чем двух тысяч наследственных болезней человека молекулярный механизм развития выяснен только у двух-трех десятков. Чаще всего развитие болезни непосредственно связано с наследственной недостаточностью или полным отсутствием синтеза одного-единственного фермента в организме больного. Типичный пример подобной связи болезни с отсутствием синтеза в печени специфического фермента — фенилпировиноградная олигофрения — наследственное заболевание, приводящее к гибели в раннем детстве или к развитию тяжелой умственной отсталости. Фермент фенилаланин-4-монооксигеназа, катализирующий реакцию превращения незаменимой аминокислоты фенилаланина в тирозин, не синтезируется в клетках печени. Лечение в основном сводится к исключению из питания ребенка (в том числе и из молока матери) аминокислоты фенилаланина. Аналогично развитие другого тяжелого наследственного заболевания — галактоземии (непереносимость молочного сахара) связано с отсутствием синтеза в клетках печени фермента, катализирующего превращение галактозы в глюкозу. Следствие подобной аномалии — накопление галактозы в тканях и развитие катаракты в раннем детстве, поражение тканей печени и мозга, нередко приводящее к гибели ребенка; лечение в этом случае сводится к исключению из диеты молочного сахара.

Помимо наследственных заболеваний энзимопатология успешно решает и проблемы патогенеза соматических болезней, в задачу которых входит выяснение молекулярных основ, например, злокачественного роста клеток, атеросклероза или ревматоидных артритов.

Энзимодиагностика. О степени поражения органов, биомембран клеток и субклеточных структур, о тяжести патологического процесса можно судить по появлению (или резкому- повышению уровня) органотропных ферментов и изоферментов в сыворотке крови больных, что составляет предмет диагностической энзимологии.

В настоящее время известно более 30 ферментов, активность которых повышается в крови при повреждении клеток различных органов в период острого и хронического заболеваний. Определение активности большинства из этих ферментов в сыворотке крови используется для диагностики и контроля лечения многих заболеваний. Для каждого из этих ферментов определены контрольные величины (уровни) активности и пределы колебания в норме как в сыворотке крови, так и в самом органе.

В качестве примера можно сослаться на результаты определения активности трансаминаз — аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы; активности этих ферментов в сыворотке крови в норме составляют 5 — 40 ME. При сердечной недостаточности и ишемической болезни сердца активность обеих трансаминаз в сыворотке крови больного незначительно повышается, однако при наступлении инфаркта миокарда уже через 20 мин активность обеих трансаминаз в сыворотке крови резко (в десятки и сотни раз) превышает уровни контрольных величин в крови здорового человека.

Кроме трансаминаз сыворотки крови при инфаркте миокарда весьма информативными диагностическими ферментными пробами являются лактатдегидрогеназный и креатинфосфокиназный тесты, относящиеся также к так называемым некротическим ферментным методам. При повреждении и распаде части сердечной мышцы вследствие закупорки коронарной артерии тромбом из обескровленной зоны вымываются в кровь продукты распада, включая ферменты. При благополучном исходе болезни уровни ферментов в сыворотке крови возвращаются к норме уже ко второму-третьему дню после инфаркта. Но при повторном инфаркте миокарда, наступающем обычно в течение первой недели болезни, электрокардиограмма обычно не улавливает его, тогда как ферментные тесты реагируют повторным и резким повышением уровня их в сыворотке крови.

Диагностическая ценность ферментов существенно повысилась после внедрения в клиническую практику методов определения изоферментов. В этой связи отметим диагностическую значимость двух ферментов, определение изоферментных спектров которых внедрено почти во всех клинических лабораториях мира.

Первый из них — лактатдегідрогеназа (ЛДГ), катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Подчеркнем, что ЛДГ является ключевым ферментом анаэробного обмена углеводов во всех живых организмах, определяя скорость образования энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ). Широко распространенный фермент ЛДГ синтезируется почти во всех клетках организма человека. Различают два типа ЛДГ: так называемый сердечный Н- (от англ. heart — сердце) и мышечный М-тип (от англ. muscle — мышцы); каждый из них состоит из четырех субъединиц. При органическом поражении сердечной мышцы, например инфаркте миокарда, в сыворотке крови резко повышается уровень общей лактатдегидрогеназы, что преимущественно обусловлено изоферментами 1 и 2 (это очень важно для точности диагноза).

При поражениях скелетной мускулатуры, а также при воспалительных процессах (гепатиты) или при вирусных поражениях ткани печени, и, наконец, при отравлении тетрахлоридом углерода или другими ядами, когда преимущественно поражается печень, вызывая некроз ткани, уровень изоферментов 3 и 4 ЛДГ резко повышается при почти неизмененном уровне 1 и 2 изоферментов. Естественно, что методы лечения будут резко отличаться; в выборе метода немалую роль играет изоферментный спектр ЛДГ Н- или М-типа.

Второй фермент, диагностическая ценность которого еще выше, особенно при инфаркте миокарда, — креатинфосфокиназа (КФК), катализирующая биосинтез креатинфосфата из креатина и АТФ. Креатинфосфокиназа — ключевой фермент биосинтеза макроэргического субстрата — креатинфосфата, играющего наряду с АТФ выдающуюся роль в биоэнергетике сердечной мышцы и всего организма. Молекула КФК также состоит из субъединиц двух типов — мышечного (М) и мозгового (В) (от англ. brain — мозг); выделены и охарактеризованы три изофермента КФК.

Диагностическая энзимология достигла значительных успехов при постановке диагноза болезней не только указанных органов, но и других, в частности почек, поджелудочной железы, желудка, кишечника и легких.

Одним из первых тестов на поражение печени является определение активности щелочной фосфатазы — фермента, катализирующего отщепление фосфатной группы от органических соединений — эфиров фосфорной кислоты. Активность данного фермента значительно повышается при первичных и вторичных новообразованиях печени, печеночном холестазе, циррозе печени. Также в клинической практике широко используют, например, определение трансамидиназы в сыворотке крови — фермента, открытого только в ткани почек и поджелудочной железы; или определяют активность фермента гистидазы, обнаруженного только в клетках печени и эпидермиса кожи. При органических поражениях этих органов, воспалительных процессах, травмах, хирургических вмешательствах в сыворотке крови больных появляются указанные ферменты, в норме в ней отсутствующие.

Энзимотерапия. В настоящее время для фармацевтических целей применяется свыше 40 ферментных препаратов животного, растительного и микробного происхождения. Получен ряд препаратов протеолитического действия (трипсин, химотрипсин и др.); специальные фибринолитические препараты (фибринолизин, стрептолиаза и др.); препараты, уменьшающие вязкость гиалуроновой кислоты (лидаза, ронидаза) и др. Эти препараты часто используются при лечении заболеваний, сопровождающихся гнойно-некротическими процессами, при тромбозах и тромбоэмболиях, нарушениях процессов пищеварения и др. Ферментные препараты находят также применение при лечении онкологических заболеваний (аспарагиназа). Новые перспективы успешного применения ферментных препаратов открывает разработка новых лекарственных форм — иммобилизованных ферментов (стрептодеказа).

Одновременно стал расширяться круг лекарственных средств, действие которых связано с инактивированием ферментов. К ним относятся ингибиторы протеолитических ферментов (пантрипин, ингитрил и др.), широко применяемые при лечении острых панкреатитов и других заболеваний; избирательно действующие ингибиторы фибринолиза (аминокапроновая кислота и др.), применяемые в качестве антигеморрагических средств; также большая группа антихолинэстеразных препаратов; ингибиторы моноаминоксидазы, применяемые как психотропные средства; ингибиторы карбоангидразы, используемые в качестве диуретиков. Эффективность аллопуринола при гиперурикемии связана с ингибированием им фермента ксантиноксидазы, действие тетурама при лечении алкоголизма — с угнетением им фермента ацетальдегидоксидазы.

Важную группу лекарственных веществ составляют реактиваторы ферментов, восстанавливающие инактивированную функцию ферментов (реактиваторы холинэстеразы).

Микробиологическим синтезом для медицинских целей получают следующие ферментные препараты:

✵ солизим — гидролизующий жиры липолитический фермент, который применяется при хронических заболеваниях ЖКТ;

✵ «-амилаза — сахаролитический фермент, гидролизующий крахмал, используется в составе лечебного препарата «фестал» при недостаточной функции поджелудочной железы;

✵ террилитин — протеолитический фермент, который рекомендуется для лечения гнойных ран ожогов, трофических язв;

✵ стрептокиназа — фибринолитический фермент, эффективный при лечении тромбозов;

✵ галактозидаза — сахаролитический фермент, хорошо зарекомендовавший себя при лечения лактазной недостаточности.

Традиционные биотехнологии, основанные на переработке тканей животных, поставляют в медицинскую практику:

✵ трипсин, химопгрипсин — протеолитические ферменты, используемые для рассасывания рубцов и спаечных процессов;

✵ урокиназу — протеолитический фермент, предназначенный для лечения тромбозов;

✵ пепсин — протеолитический фермент, незаменимый при расстройствах пищеварения.

Те же традиционные биотехнологии, но основанные на переработке растительного сырья, дают такие протеазы, как бромелин, папаин, фицин, которые используются в заместительной терапии при нарушении пищеварения и в серологической диагностике для выявления резус-фактора.

Лекарственные формы на основе ферментов характеризуются большим разнообразием — это таблетки, капсулы, мази, аэрозоли.

В нашей стране и за рубежом первое место по объему выпускаемых ферментных препаратов занимают протеолитические, наиболее глубоко изученные среди всех известных ферментов. Протеазы в числе первых белков были получены в высокоочищенном кристаллическом состоянии. Расшифрована первичная структура таких фюрментов, как химотрипсин, трипсин, папаин, субтилизин. К настоящему времени известно четыре класса протеаз: сериновые, карбоксильные, цистеиновые и металлопротеазы. Классификация основана на специфическом строении активных центров этих ферментов, которые представляют уникальное сочетание определенных аминокислотных остатков, расположенных в разных точках полипептидной цепи. Для идентификации определенных реакционных групп используют специфические ингибиторы.

Класс сериновых или щелочных протеаз объединяет группу протеолитических ферментов, содержащих в активном центре триаду: аспарагин — серин — гистидин. Специфическими ингибиторами этих ферментов, чья максимальная активность проявляется в диапазоне pH 7,5—12,5, являются фенилметилсульфонилфторид и диизопропилфторфосфат.

К щелочным протеазам относятся ферменты из животного сырья: трипсин и химотрипсин, которые широко используются в медицинской практике как для местного и парентерального применения. Их применяют и в виде аэрозолей при воспалительных заболеваниях дыхательных путей — трахеитах, пневмонии, а также в виде внутримышечных инъекций при остеомиелитах, тромбофлебитах и разных формах пародонтоза. По отношению к здоровым тканям эти препараты неактивны и безопасны в связи с наличием в этих тканях ингибиторов трипсина.

Из различных штаммов микроорганизмов Bacillus subtilis выделены и детально изучены внеклеточные щелочные протеиназы. Субтилизины — одни из немногих белков, для которых определена трехмерная структура и построена модель молекулы. Благодаря широкой специфичности действия, эти ферменты гидролизуют до 80 связей в белках. Они обладают эстеразной и амидазной активностями; стабильны в диапазоне pH 5—10, однако оптимум действия проявляют при pH 9—10. По механизму действия и субстратной специфичности субтилизины близки к трипсину и химотрипсину, несмотря на отсутствие какого-то бы ни было сходства в структуре между ними. В биотехнологической промышленности щелочные протеазы из бактериальных культур задействуются для гидролиза белков с последующем использованием гидролизатов в качестве компонентов питательных сред, поставляемых в клинико-бактериологические лаборатории.

Основными представителями класса карбоксильных или кислых протеаз являются пепсин, химозин и протеазы из грибов. Первичная структура пепсина расшифрована и включает 300 аминокислотных остатков. Пепсин продуцируется клетками слизистой оболочки желудка в виде зимогена — неактивной формы фермента, которая активируется под действием другого фермента-активатора, отщепляющего в молекуле зимогена аминокислоту с N-конца. В активном центре зимогена содержатся две карбоксильные группы аспарагиновой кислоты. Специфическим ингибитором протеаз данного класса является природный пепстатин. Для кислых протеаз характерны некоторые общие признаки. Они стабильны в кислой среде (pH 2,0 —5,0); оптимум действия при pH 1,5 — 5,0 и быстро инактивируются при нейтральном значении pH. Пепсин и химозин не имеют а-спиралей, но характеризуются наличием антипараллельной ß-структуры. Японские исследователи полагают, что устойчивость кислых протеаз при низких значениях pH связана именно с этой особенностью их вторичной структуры.

Тиолзависимые или цистеиновые протеазы в медицинской практике представляют папаин из дынного дерева, фицин из латекса растений, бромелин из плодов ананаса и ряд ферментов из микроорганизмов.

Цистеиновые протеазы содержат в активном центре триаду аминокислот — цистеин-гистидин-аспарагиновая кислота. Активность тиоловых протеаз подавляется специфическими блокаторами сульфгидрильных групп (йодацетатом, йодацетамидом, П-хлормеркурибензоатом, ионами тяжелых металлов). Их максимальная активность проявляется при pH 6,0—9,5. Папаин и химопапаин устойчивы к действию температуры. Отличительная особенность этих ферментов — высокая устойчивость к денатурирующим веществам, например в 6—8 М мочевине или в 70% метиловом спирте их активность не изменяется.

При изучении их гидролитической активности было показано, что эти ферменты расщепляют белки глубже по сравнению с ферментами животного и бактериального происхождения. Так, папаин способен гидролизовать практически любые пептидные связи. Кроме пептидных связей тиолзависимые ферменты гидролизуют амидные и эфирные связи.

Бромелин, папаин и фицин используются в медицине для лизирования нежизнеспособных некротических тканей при лечении гнойно-воспалительных процессов. В результате энзиматического очищения ран сроки заживления сокращаются в 1,5 — 2,0 раза. Бромелин, папаин и фицин применяются в заместительной терапии при нарушении пищеварения, а также в акушерской практике при выявлении и предотвращении резус-конфликтных ситуаций.

Класс нейтральных или металлопротеаз составляют ферменты в основном микробного происхождения. Нейтральные протеазы в активном центре содержат ионы Са²⁺ и Zn²⁺. Эффективные при нейтральных значениях pH металлопротеазы проявляют строго эндопептидазную активность и не расщепляют пептидные связи, образованные аминокислотными остатками со свободной NH₂- И СООН-группами. Нейтральные протеазы гидролизуют казеин, желатин, яичный альбумин и в отличие от субтилизинов не обладают эстеразным действием. В медицинской практике широко используется террилитин из Aspergillus terricola для лечения острых гнойных заболеваний и трофических язв. Ингаляциями террилитином лечат воспалительные процессы в легких. Другая нейтральная протеаза микробного происхождения — коллагеназа применяется в глазной хирургии для рассасывания рубцовой ткани.

Несмотря на то, что уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов — рибонуклеазы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома С, трудно ожидать, что синтетическое получение ферментов получит широкое распространение в ближайшие десятилетия ввиду сложности и дороговизны, поэтому единственным способом получения ферментов остается выделение их из биологических объектов. Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, заключающийся в осаждении и быстром обезвоживании (при температуре не выше 10 °С) тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты.

К числу таких методов относится и получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Адсорбционный метод выделения и очистки ферментов разработан детально. Одна из его модификаций — аффинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему вещества выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, нужный фермент элюирует с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноступенчатую (аффинная сорбция — элюция) схему выделения.

Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование.

Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала, вплоть до разрушения субклеточных структур (в частности, лизосом, митохондрий, ядер), несущих в своем составе многие индивидуальные ферменты. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка, которая ведет к потере ферментативной активности. Поэтому данные технологические операции проводят в присутствии защитных добавок, в частности, SH-содержащих соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина и др.). Очень важно поддерживать на всех этапах выделения ферментов низкую температуру, так как некоторые из ферментов даже при 80 °С теряют активность. Для оценки гомогенности ферментного препарата прибегают к обычным методам белковой химии. О степени чистоты ферментного препарата судят, как: правило, по его биологической активности: если активность при дальнейшей очистке не возрастает, препарат можно считать гомогенным.

В качестве примера можно привести краткие технологические схемы получения трех ферментов: террилитина, стрептокиназы и липазы.

Протеолитический ферментный препарат террилитин получают культивированием штамма Aspergillus terricola с последующим отделением от мицелия. Затем полученный нативный раствор освобождают от пигментов пропусканием через анионит (продукт поликонденсации феноксипроизводных формальдегида при нейтральном pH). Далее методом ультрафильтрации раствор ферментов обессоливают и концентрируют; полученный концентрат лиофилизируют. С целью сокращения длительности процесса и увеличения выхода целевого продукта депигментированный нативный раствор дополнительно очищают от высокомолекулярных балластных веществ.

Стрептокиназу получают непрерывным культивированием продуцента Streptococcus egyisimilis на питательной среде, включающей мясопептонный бульон, содержащий настой из говяжьих сердец, глюкозу и бикарбонат калия. Подачу питательной среды регулируют в зависимости от изменения pH культуральной взвеси.

Далее целевой продукт выделяют и очищают. Для повышения выхода целевого продукта питательную среду перед культивированием нагревают до заданного pH.

Липазу получают из семян хлопчатника, которые облучают определенное время импульсным концентрированным светом. Затем семена проращивают в темноте. Проросшие семена измельчают и обрабатывают ацетоном, после чего последовательным осаждением раствором сульфата аммония и ацетона липазу выделяют из ацетонового экстракта. Для увеличения выхода целевого продукта и повышения его активности перед облучением семена предварительно замачивают.

Контрольные вопросы

1. Какие химические модификации стероидной молекулы осуществляются с помощью биотрансформации?

2. Что служит основным источником сырья для производства стероидных препаратов и почему?

3. На чем основан выбор микроорганизмов, способных трансформировать стероиды?

4. Что лежит в основе классификации витаминов?

5. Какие методы доминируют в производстве витаминов?

6. Какая стадия получения аскорбиновой кислоты является биотехнологическим методом?

7. Какие лекарственные препараты на основе аминокислот существуют?

8. В чем отличие биосинтеза треонина от биосинтеза лизина?

9. Каковы причины развития дисбактериоза?

10. Какие требования предъявляются к производственному штамму микроорганизма-симбионта?

11. Какие основные классы ферментов существуют?

12. Каковы особенности методов очистки и выделения ферментов?