Биотехнология - Ю.О. Сазыкин 2006

Общая биотехнология
Биобъекты: способы их создания и совершенствования
Создание биообъектов методами генетической инженерии - Рекомбинантные белки как лекарственные средства

Успехи генетической инженерии привели к тому, что свыше 100 белков человека (биорегуляторов, корректоров гомеостаза, факторов врожденного и приобретенного иммунитета) могут сохранять свою видоспецифичность. Они нарабатываются как лекарственные средства путем микробиологического синтеза. При этом технология рекомбинантной ДНК позволяет их совершенствовать: повышать физиологическую активность, снижать вероятность побочных реакций после введения и т.д. Основным при получении рекомбинантных белков является решение проблемы дефицита сырья, так как из человеческих тканей в промышленном масштабе получать их, естественно, невозможно.

При выборе микроорганизма (как продуцента чужеродного белка предполагаемого лекарственного препарата) необходимо:

✵ наиболее полно изучить геном;

✵ подробно исследовать метаболизм на уровне вида;

✵ чтобы микроорганизм обладал умеренной патогенностью (в идеале предполагается ее полное отсутствие);

✵ чтобы микроорганизм был способен расти в условиях производства на недефицитных и экономически доступных средах.

Избранные в качестве предполагаемых продуцентов микроорганизмы оцениваются и изучаются уже на уровне конкретных штаммов. При необходимости штаммы-биообъекты (как носители чужеродного генетического материала и продуценты чужеродного белка) могут быть усовершенствованы методами генетической инженерии, что позволяет свести к минимуму вероятность протеолиза чужеродных белков, гидролиза чужеродной информационной РНК и «исключения» чужеродных генов из генома. Таким образом, в данном случае общей целью является ограничение активности способствующих гомеостазу клетки систем репарации, включающих нуклеазы и протеазы.

Иногда чужеродный белок может откладываться в клетке продуцента в виде белковых гранул (в недоступной для протеаз форме), что характерно, например, для Е. coli.

Особое внимание привлекает проблема секреции чужеродных белков, так как выделение целевого белка в высокоочищенном виде из культуральной жидкости — задача гораздо более легкая, чем выделение его из клетки. Как известно, секретируемые белки отличаются от несекретируемых тем, что имеют на N-терминусе так называемую лидерную последовательность аминокислотных остатков, которая способствует переносу их через мембрану клетки в среду. На последней стадии контакта секретируемого белка с поверхностью образовавшей его клетки лидерная последовательность отделяется от основной полипептидной цепи. В соответствии с этим вводимый в микробную клетку чужеродный ген (точнее оперон) подвергается модификации: либо его нуклеотидная последовательность целенаправленно увеличивается таким образом, чтобы в чужеродном белке оказывалась лидерная последовательность аминокислот, либо конструируются гибридные опероны с общим промотором, включающие ген чужеродного белка и ген секретируемого белка, лидерная последовательность которого извлекает из клетки чужеродный белок. Далее два белка разделяются принятыми химическими или ферментативными методами.

В качестве продуцентов рекомбинантных белков человека чаще других в настоящее время используются: Escherichia coli (кишечная палочка), Bacillus subtilis (сенная палочка), Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи). Первые два микроорганизма — прокариоты, последний — эукариот. Эти организмы достаточно безопасны, однако попадание их (как продуцентов того или иного человеческого белка) в окружающую среду по ряду причин нежелательно. В связи с этим существуют принятые и тщательно соблюдаемые правила работы с рекомбинантами.

Безопасность должна соблюдаться на генетическом и на физическом уровнях. Безопасность на генетическом уровне означает, что в геном продуцента чужеродного белка {помимо чужеродных генов) вносится еще одно изменение — из него удаляются некоторые гены, например, участвующие в синтезе аминокислоты, существенной для роста микроорганизма. Иными словами, организм делается зависимым от наличия в среде этой аминокислоты. Если же клетки данного микроорганизма оказываются вне среды, то они не размножаются, т.е. опасность заражения территории предприятия культурой рекомбинанта значительно уменьшается.

Нельзя не отметить, что продуценты чужеродного белка не отличаются высокой способностью к выживанию в природных условиях. Точнее, они утрачивают способность образовывать ненужный им чужеродный белок, так как потеря этой способности ускоряет размножение клеток; медленно же размножающиеся клетки, которые продолжают синтезировать чужеродный им белок, постепенно исчезают из популяции.

Меры безопасности принимаются и на физическом уровне: на всех местах выброса газа устанавливают микробиологические фильтры. По завершении рабочего цикла без разъединения системы, что может привести к понижению давления во всех емкостях, где могут оказаться клетки рекомбинанта, так как вследствие нарушения герметизации воздух вместе с чужеродными клетками будет втягиваться в систему, оборудование стерилизуют. И последнее — на производстве должны соблюдаться все требования «Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств» (GMP).

Все перечисленное в равной мере относится к производству любых рекомбинантных белков. В качестве примера можно взять производство рекомбинантного инсулина.

На первом месте по объему производства и стоимости продукции рекомбинантного белка как лекарственного средства находится хорошо известный гормон — инсулин, контролирующий уровень глюкозы в крови. Промышленное производство рекомбинантного инсулина было впервые начато в 1982 г. В настоящее время его годовой оборот составляет около одной трети общего оборота всех рекомбинантных белков, используемых в медицине.

Инсулин состоит из двух полипептидных цепей. Цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, а цепь 5—30 аминокислотных остатков. Между собой цепи А и В связаны двумя дисульфидными (—S —S —) связями. Еще одна такая связь имеется между остатками цистеина, находящимися в А-цепи. Общая стереоструктура молекулы поддерживается этими тремя дисульфидными связями, и любое изменение в ней ведет к исчезновению гормональной активности инсулина.

Традиционный источник инсулина — поджелудочные железы сельскохозяйственных животных — свиней и крупного рогатого скота. Но используется не вся железа, а лишь ткань так называемых «островков Лангерганса».

Российский рынок ежегодно потребляет примерно одну тонну инсулина. Подсчитано, что для получения такого количества инсулина требуется приблизительно 35 млн голов свиней. Известно также, что количество лиц, нуждающихся в систематическом введении инсулина, ежегодно возрастает на несколько процентов, поэтому проблема дефицита сырья применительно к инсулину животного происхождения существует до сих пор.

Однако не только этим обстоятельством обусловлен интерес к рекомбинантному инсулину, получаемому путем микробиологического синтеза. Инсулин, выделяемый из поджелудочной железы свиней, отличается от инсулина человека на один аминокислотный остаток. Инсулин крупного рогатого скота — на три. Это означает, что при введении их человеку он получает белок (полипептид) иной видоспецифичности. Следовательно, существует определенный процент случаев проявления аллергии. Также при парентеральном введении (особенно у детей) может наблюдаться болезненность. Одновременно приходится сталкиваться с проблемой передозирования, поскольку в случае аллергии инсулин (как антиген) частично нейтрализуется и, соответственно, вводить его необходимо больше.

Кроме того, предшественник инсулина при его биосинтезе в животной ткани, так называемый проинсулин, содержит еще одну полипептидную цепь (пептид С). Позднее эта цепь отделяется от зрелой (завершенной) формы гормона, однако при выделении инсулина из животных клеток от примеси проинсулина избавиться трудно. Как раз в пептиде С видовые различия аминокислотной последовательности гораздо более велики (по сравнению с самим инсулином), т.е. побочные эффекты инсулина Животного происхождения в значительной степени обусловлены «чужим» пептидом.

Рекомбинантный инсулин, синтезируемый в микробной клетке, лишен указанных недостатков, поскольку аминокислотная последовательность двух его цепей кодируется генами человека. В принципе, он идентичен инсулину из человеческой ткани. Правда, его выделение и очистка требуют особой тщательности, так как в этом случае необходимо освобождаться от микробных липо- и гликопротеинов. Их примеси в рекомбинантном инсулине вследствие токсичности могут вызвать нежелательные побочные эффекты. Однако это уже относится к качеству отдельных серий препарата и культуре производства на данном предприятии.

В настоящее время в производстве рекомбинантного инсулина конкурируют две принципиально разные технологии. Согласно первой в клетки микроорганизма-хозяина вводят плазмиду, содержащую последовательность нуклеотидов, соответствующую проинсулину (цепи А С-пептиду, цепи В и далее лидерному пептиду и промоторному участку). В дальнейшем С-пептид отделяется. Особенность второй — раздельное получение цепи А и цепи В в двух микробных культурах, которые впоследствии объединяются.

В лабораториях одной из зарубежных фирм разработана схема получения рекомбинантного инсулина, основанная на раздельном биосинтезе двух его цепей; каждая цепь синтезируется в отдельной культуре Е. coli. Предварительно на основе плазмид конструировались векторы (один — для гена цепи А, другой — для гена цепи В). К каждой последовательности присоединялся триплет, соответствующий метионину и нуклеотидам гена индуцибельного фермента бетагалактозидазы, включая оперой. Таким образом, между нуклеотидными последовательностями цепей А, В и бетагалактозидазой оказывался метиониновый триплет. Это обстоятельство является очень важным для завершающей стадии работы. Ферментация двух культур с вектором, несущим цепь А, и вектором, несущим цепь В, проводилась на среде с лактозой (индуктором синтеза бетагалактозидазы). Если не расщепить глюкозу, то она может быть использована организмом как источник энергии. Поскольку бетагалактозидаза и цепь А (или В) имели в векторе общий промотор, накопление бетагалактозидазы сопровождалось накоплением больших количеств связанной с ней цепи А (В). По окончании ферментации из двух культур выделялись два белка: цепь А плюс бетагалактозидаза и цепь В плюс бетагалактозидаза. Метиониновый остаток, связывающий каждую инсулиновую цепь с бетагалактозидазой, разрушался с помощью BrCN, а инсулиновые цепи при этом освобождались и выделялись.

На последнем (чисто химическом) этапе работы происходило объединение цепей А и В в молекулу инсулина (за счет двух дисульфидных связей; третья дисульфидная связь формируется между остатками цистеина в цепи А).

Гормон роста (соматотропин). В клинике испытан еще один рекомбинантный белок, полученный методом микробиологического синтеза, — гормон роста человека, который секретируется передней долей гипофиза и содержит 191 аминокислотный остаток. В организме человека этот гормон необходим для роста костей. При внутриутробном развитии он не нужен, однако его недостаточность резко проявляется в позднем детском возрасте и приводит к карликовости.

Ген гормона роста человека клонирован в Е. coli. Биологическая активность выделенного белка была идентична образцу, полученному из гипофиза. Интенсивно ведутся работы по повышению избирательности действия гормона роста (уменьшению его связывания с рецептором пролактина).

Эритропоэтин. Этот гликопротеин необходим для созревания (дифференцировки) эритроцитоидных клеток. Белок видоспецифичен, вырабатывается в почках. Эритропоэтин нужен при анемии, вызываемой почечной недостаточностью, а также при анемиях, которые могут наблюдаться при гемотрансфузии, облучении и химиотерапии опухолей, т.е. всюду, где может происходить угнетение кроветворения.

В США свыше 100 тыс. человек получают по две инъекции эритропоэтина в неделю (ампулы эритропоэтина в цитратном буфере по 2000 — 4000 ЕД содержат также сывороточный альбумин). Отметим и такой своеобразный факт: во время олимпийских игр и других международных соревнований спортсменов, злоупотребляющих эритропоэтином, дисквалифицируют.

Способ получения рекомбинантного эритропоэтина (необходимо подчеркнуть: гликопротеина) имеет важную особенность — ген эритропоэтина человека встраивается не в микробные, а в животные клетки (яйцеклетки китайского хомячка), где белок может быть гликозилирован. При этом продуцентом эритропоэтина является монослойная культура этих клеток.

Пептидные факторы роста тканей. Эти многочисленные биорегуляторы обладают как видовой, так и тканевой специфичностью. Иногда применительно к ним используется определение: гормоны, образуемые вне желез внутренней секреции. Их наработка для медицинской практики возможна лишь путем микробиологического синтеза, т.е. как рекомбинантных белков. В настоящее время подробно изучены эпидермальный фактор роста (ЭФР) и некоторые другие. Исследования в этом направлении продолжаются, но уже сейчас получены положительные результаты в экспериментах (например, ускорение заживления ран при использовании ЭФР), однако остается нерешенным вопрос о полной гарантии невозможности злокачественного перерождения тканей.

Рекомбинантные белковые факторы врожденного иммунитета.

К числу используемых в качестве лекарственных средств видоспецифических белков относятся интерфероны — факторы врожденного иммунитета, открытые в свое время как белки, вырабатываемые клетками, зараженными вирусами. Они индуцируют локальные и системные противовирусные реакции в других клетках и, соответственно, используются как противовирусные препараты. Потенциально интерфероны представляют интерес и как противоопухолевые агенты. Их принято делить на три группы: а, ß и у (из разных типов клеток).

До недавнего времени интерфероны из человеческих клеток были доступны лишь в малых количествах. Как медицинский препарат использовался, главным образом, лейкоцитарный интерферон. Его источником служила кровь, получаемая из родильных домов. В настоящее время ген лейкоцитарного интерферона получен химическим синтезом. Затем он был включен в плазмиды, которые в свою очередь были введены в клетки кишечной палочки и дрожжей, ставшие таким образом продуцентами лейкоцитарного интерферона человека.

Ген интерферона из фибробластов человека был клонирован в клетках кишечной палочки. Также ведется работа по созданию методами генной инженерии гибридных интерферонов с большей противораковой активностью, чем у природных. Это относится к получению гибридов между интерферонами а₁ и а₂.

Вообще возможность получения и использования в медицине иммуномодифицированных рекомбинантных белков привлекает все большее внимание. Можно отметить, в частности, цикл исследований основного или главного катионного белка нейтрофилов, который обладает одновременно бактерицидной активностью и способностью нейтрализовать эндотоксин грамотрицательных бактерий вследствие повышения проницаемости внешней мембраны последних (шифр белка: BPI — bactericidal permeability increasing). Этот белок имеет молекулярную массу 55 кДа и обладает исключительно высоким сродством к липиду Л (эндотоксину) внешней мембраны грамотрицательных бактерий.

Использование его как химиотерапевтического препарата, вводимого извне «в помощь» нейтрофилам своего организма, является весьма перспективным. Рационально использовать BPI человеческого происхождения во избежание аллергических реакций, но в данном случае, естественно, возникает проблема дефицита сырья. Отметим, что данный белок, являясь ингибитором воспалительных реакций, на уровне эндотоксина конкурирует с одним из белков острой фазы (образуемых печенью), который стимулирует противоспалительные реакции. В настоящее время BPI получен генно-инженерными методами, причем его молекулярная масса значительно меньше в лекарственной форме, так как в этом случае используется лишь N-терминальная часть рекомбинантного белка с молекулярной массой 21 кДа (так называемый rBPI₂₁).