Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Разделение смесей белков и пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Адсорбция и распределение полипептидов и белков
Подготовка к нанесению образца

ОФ-носители используют для предварительной очистки и концентрирования полипептидов. Описано применение мини-колонок, заполненных Partisil-10 ODS (10 мкм, размер пор 5,5— 6,0 нм, фирма Whatman, Англия), для крупномасштабного фракционирования клеточных экстрактов и культуральных сред [14]. Использование растворов с кислыми pH помогает инактивировать протеазы. Разделения проводят в растворах, содержащих хлорид натрия и ацетонитрил. Например, клеточные экстракты хроматографировали па патронах Sep-Pak (носитель, силикагель, модифицированный октадецилхлоросиланом) в растворе 5%-поп (об./об.) муравьиной кислоты, содержащей 1% (масс./об.) хлорида натрия и 1% (об./об.) ТФУ [1]. Ткани делипидировали обработкой ацетоном при —20 °С, экстрагировали гексаном, ацетоном, сушили. После нанесения образца на колонку патрон промывали 0,1%-ной ТФУ; компоненты смеси элюировали 80%-ным ацетонитрилом, содержащим 0,1% ТФУ. Элюат разбавляли 0,1% ТФУ в соотношении 1 :4 и наносили на аналитическую колонку.

При выделении интерферона 60 мл раствора частично очищенного белка, полученного после фракционирования на сефадексе G-100 в 4 М мочевине, наносили на ОФ-колонку [26]. Патроны Sep-Pak применяли для отделения пептидов от мочевины после гель-фильтрации в растворах муравьиной кислоты [31]. Элюирование проводили в ацетате, содержащем ацетонитрил.

Таким образом, используя специфическую сорбцию пептидов и белков, на ОФ-колонки можно наносить большие объемы экстрактов биологического материала. Правильный выбор природы и содержания органического растворителя помогает увеличить селективность разделения [23].

Условия нанесения образца па ОФ-колонку существенно влияют на результаты фракционирования. При выделении пептидов для структурных исследований практикуется нанесение образцов в растворах, содержащих мочевину или Gu∙HCl. Это помогает растворить образцы, предотвращает агрегацию молекул, способствует адсорбции образца на носителе. Адсорбция образца, позволяющая нанести вещество ровным слоем и создать оптимальные условия для взаимодействий между подвижной фазой и растворенным веществом, является одним из важнейших условий успешного фракционирования полипептидов. При больших объемах наносимого образца повышается эффективность последующих хроматографических разделений.