Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и полипептидных цепей
Стехиометрическое соотношение мономеров в олигомере
Гибридизация

Сведения о субъединичном составе олигомеров могут быть получены по результатам гибридизации in vitro двух различных очищенных форм белка. Это могут быть гомологичные белки, изоферменты или олигомеры, модифицированные химическим путем; важно только, чтобы две формы белка имели какие-либо отличительные признаки, по которым можно было бы различать и определять полученные гибридные молекулы. По количеству образующихся гибридов можно определить число мономеров в олигомере. Например, можно предположить, что при сборке тетрамера из идентичных субъединиц а и ß могут возникать пять различных комплексов: аааа, аасф, aaßß, aßßß и ßßßß.

Если мономеры не идентичны (в частности, аспартаттранскарбамилаза содержит 6 каталитических и 6 регуляторных субъединиц), задача существенно сложнее. Если субъединицы разные, но в структурном и функциональном отношении эквивалентны, то количество N возможных гибридов определяется следующей формулой:

где s — число субъединиц, а m — суммарное число различных типов единиц.

Часто исследователь не располагает гомологичными белками (или изоферментами), необходимыми для гидридизации; поэтому в более общем случае рекомендуется химическая модификация. При исследовании субъединичной структуры альдолазы модификацию проводили с помощью янтарного ангидрида [120]. В результате положительно заряженные остатки лизина приобретали отрицательный заряд. Могут быть использованы также ангидриды других дикарбоновых кислот, однако реакция с ними обратима. Такой способ модификации субъединиц может привести к диссоциации олигомера из-за электростатического отталкивания одинаково заряженных группировок. Проблему диссоциации можно решить путем частичного ацилирования янтарным ангидридом, однако при этом возникает задача получения гомогенных препаратов. Метод гибридизации не дает результатов, если до и после модификации белок имеет разную четвертичную структуру или его вообще не удается реконструировать после диссоциации на мономеры.

1.4.3.1. Методики. Далее в качестве примера приводятся две различные методики сборки гибридных белков из гомологов и химически модифицированных субъединиц.

Гибридизация гемоглобина [178]. Смесь гемоглобина S и радиоактивно меченного гемоглобина A (1:1) с целью диссоциации на а- и ß-цепи диализуют при 3 °С в течение 48 ч против 0,1 М натрийацетатного буфера (pH 5). Сборку проводят путем повторного диализа против дистиллированной воды в течение 24 ч. Хроматографическим путем получают радиоактивно меченный гемоглобин S — гибридный белок, образованный в результате обмена а-цепями гемоглобина А и S.

Гибридизация альдолазы [120], cмешивают в различных мольных соотношениях нативную и ацилированную (янтарным ангидридом) альдолазу (концентрация белка 0,4%) в 0,02 М калийфосфатном буфере (pH 6,5), содержащем 4,0 М мочевину, 0,002 М ЭДТА и ОД М дитиотрсит при 4 °С. Спустя 30 мин образцы диализуют в течение 12 ч для удаления мочевины против буфера, содержащего 0,5 М NaCl, 0,2 мМ дитиотрент, затем 2—3 раза против буфера, не содержащего NaCl.