Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Концентрирование растворов белков
Методики

Ниже приведено несколько примеров концентрирования белков различными методами.

8.5.1.1. Количественное извлечение белков из разбавленных растворов [396]. К 0,1 мл раствора белка приливают 0,4 мл метанола, перемешивают и центрифугируют 10 с при 9000 g (на этой и последующих стадиях). Добавляют 0,1 мл хлороформа (0,2 мл для образцов с высокой концентрацией фосфолипидов), перемешивают и центрифугируют 1 мин. Верхний слой отбрасывают, к нижней хлороформсодержащей фазе приливают 0,3 мл метанола, перемешивают и центрифугируют 2 мин. Отделяют супернатант и высушивают осадок в потоке воздуха.

Для электрофоретического контроля гомогенности выделенного образца растворяют его в 50—100 мкл ДСН (5%-ный раствор, масс./об.) или непосредственно в 50 мкл буфера, содержащего 5% ДСН.

Методика может быть использована как для растворимых, так и для гидрофобных белков, на получающиеся результаты не влияет присутствие в. исходном растворе детергентов, липидов, солей, 2-меркаптоэтанола. При содержании в исходном растворе 40—120 мкг белка в 0,1 мл выходы составляют 92—100%.

8.5.1.2. Электрофорез с использованием жидких мембран [384, 385]. Электрофорез с нелинейным градиентом pH позволяет осуществить концентрирование белков с различными зарядами быстрее, чем изоэлектрофокусирование. Два наложенных друг на друга слоя, один из аминокислот (гистидина или валина) и другой из амфолитов (Servalyte), создают жидкую мембрану, служащую барьером для белка. Таким образом 200 мл раствора рибонуклеази было сконцентрировано в 48,3 раза за 4 ч, выход белка составил 96,6% [385]. В системе, состоящей из фармалитов (pH 2,5—5,0), гистидина (р/ 7,64) и амфолитов (pH 9—11), при напряжении 400 В за 5 ч были сконцентрированы на двух границах раздела фаз кислая и основная изоформы пероксидазы хрена (рІ 4,0 и 8,4) [384].

8.5.1.3. Концентрирование микрограммовых количеств белка [237]. Выделение микрограммовых количеств белков из разбавленных растворов основано на осаждении трихлороуксусной кислотой с добавлением дезоксихолата. Детергейт, часто применяемый при выделении мембранных белков, затем удаляется экстракцией.

а) Осаждение белка

1. Добавляют 120 мкл дезоксихолата натрия (2%-ный, масс./об.) к раствору до конечной концентрации белка 80 мкг/мл. Перемешивают и оставляют стоять во льду 30 мин. Концентрация детергента может варьировать от 50 до 500 мкг/мл, не оказывая влияния па выход.

2. Приливают 10 мл холодной трихлороуксусной кислоты (24%, масс./об.) до конечной концентрации 6%* Оставляют стоять во льду в течение 1 ч до полного осаждения комплекса белок — детергент.

3. Центрифугируют при 2400 g и 4 °С в бакет-роторе 45 мин.

4. Осторожно отделяют супернатант отсасыванием.

5. Растворяют осадок в 0,5 мл 62,5 мМ трис-НСl (pH 6,8), содержащего 3% ДСН, доводят раствор до 0,5 М по NaHCО₃ (конечный pH 8,8).

6. Диализуют раствор в течение ночи при комнатной температуре против 2 л 6,25 мМ трис-НСl (pH 6,8), содержащего 0,3 % ДСН.

7. Лиофилизуют раствор в склянках (7 мл) с завинчивающимися крышками или пробирках.

б) Экстракция детергента

1. Добавляют к высушенному образцу 1 мл экстракционной смеси: ацетон — уксусная кислота — триэтиламин (90 : 5 : 5).

2. Быстро переносят раствор в коническую центрифужную пробирку.

3. Оставляют стоять во льду в течение 1 ч для осаждения белка.

4. Центрифугируют в настольной центрифуге при комнатной температуре.

5. Удаляют супернатант отсасыванием.

6. Промывают осадок сначала 1 мл экстракционного раствора и затем 1 мл ацетона.

7. Высушивают под азотом. Выход 40—80%.