Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и полипептидных цепей
Стехиометрическое соотношение мономеров в олигомере
Электрофорез в полиакриламидном геле
Если олигомер включает два и более различных типов мономеров (или полипептидных цепей), которые могут быть разделены электрофорезом в ПААГ, то стехиометрическое содержание субъединиц можно определить денситометрией или с помощью введения радиоактивной метки. Предварительно субъединицы выделяют в очищенном состоянии и определяют в молекуле содержание остатков меченых аминокислот; в случае денситометрии строят градуировочные графики связывания красителя.
1.4.5.1. Введение радиоактивной метки. Каждая субъединица исследуемого белка должна содержать по крайней мере один аминокислотный остаток, по которому можно ввести радиоактивную метку. С целью повышения чувствительности рекомендуется вводить метку по нескольким точкам. Введение метки проводят в жестких денатурирующих условиях, когда все аминокислотные остатки включают метку в равной степени. Более того, реакция модификации должна быть специфичной и проходить с предельной полнотой. При этом важно, чтобы аминокислотные остатки сохранили заряд. Если же заряд изменился, то необходимо специально исследовать возможность отделения модифицированных немеченых субъединиц с помощью электрофореза.
Большинство белков содержат достаточно много остатков лизина, которые могут быть специфически помечены путем образования амидинов без изменения заряда. Условия проведения реакции выбирают такими, чтобы N-концевые аминокислотные остатки не затрагивались. Другим возможным объектом модификации могут служить остатки цистеина. Соответствующие реакции рассматриваются в разд. 1.5.1. Наибольший интерес из них представляет алкилирование иодоуксусной кислотой или иодоацeтамидом. В случае иодоуксусной кислоты белок приобретает дополнительный отрицательный заряд. С целью введения метки можно восстановить дисульфидные связи, а затем провести алкилирование. Если мономер включает полипептидные цепи, связанные дисульфидными связями, этот метод неприменим. С помощью введения метки можно определять внутри- и межцепочечные дисульфидные связи, проводя модификацию в обычных и денатурирующих условиях. Межцепочечные связи сывороточной холинэстеразы человека были восстановлены и алкилированы в отсутствие денатурирующих агентов [106].
Если предположить, что модификация различных мономеров проходит одинаково, то радиоактивность Di (расп./мин) мономера і пропорциональна молярному содержанию мономера и содержанию Li потенциально модифицированных групп в 1 моле мономера і:
Для определения Li устанавливают аминокислотный состав и. молекулярную массу очищенных мономеров. Для любых двух мономеров і и j справедливо
Введение радиоактивной метки. Методика алкилирования остатков цистеина иодоуксусной кислотой описана в разд. 2.2.1.1. Меченая [14С]иодоуксусная кислота может быть разбавлена немеченым реагентом.
Известен метод пептидных карт, включающий операции амидинирования белка метнл[14С]иминоацетатом, электрофорез в тонком слое, хроматографию и авторадиографию [17].
Амидинирования белков. [16]. Образцы белка (до 1 мг) диализуют против 1 мМ ЭДТА (pH 7,0) и высушивают лиофильно. Сухой остаток растворяют в 0,1 мл 0,2 М натрийборатного буфера (pH 8,5), содержащего 5 М гуанидин-НСl, 2 мМ ЭДТА и 0,01%-ный (масс./об. )азид натрия; добавляют 0,01 мл 1 М раствора метил-1-[14С]иминоацетата (концентрация реагента в реакционной смеси 0,1 моль/л) и инкубируют при комнатной температуре и течение по крайней мере 5 ч. После включения метки образец разбавляют до необходимой концентрации и проводят электрофорез в ПААГ. Образец может быть диалнзован против электрофоретического буфера с целью удаления избытка радиоактивно меченных примесей.
Измерение радиоактивности [16]. По завершении электрофореза белковые зоны проявляют (окрашивают), вырезают, помещают в пластмассовые пробирки для измерения скорости счета и высушивают в вакууме. Высушенный гель выдерживают в 0,3 мл 30%-ного Н2О2, содержащего 1% NH4ОH, при 60 "С в течение 6 ч до полного растворения. В контрольных опытах было показано, что при этом не происходит потери метки. Добавляют сцинтиллятор 13,0 мл смеси толуол — тритон 2:1)], содержащий 2,5-дифенилоксазол (5 г/л), и измеряют скорость счета. В качестве внешнего стандарта используется 133Ba. Эффективность счета составляет обычно 70—75%. Для определения фона используют кусочки геля без метки, обработанного аналогичным образом.
1.4.5.2. Денситометрия. Для обнаружения белков в геле часто используют краситель кумасси, однако при высоких концентрациях белка наблюдаются отклонения от закона Бэра. Зависимость оптической плотности от концентрации линейна при концентрациях белка 1—50 мкг; влияют тип белка, размеры геля и длина электрофоретического пробега зоны. Денситометрия окрашенных зон невозможна, если зоны сильно отличаются по содержанию белка. Способность связывать молекулы красителя сильно варьирует у различных белков. Полагают, что связывание красителя основано на электростатическом взаимодействии между молекулой красителя и основными группами белка (т. е. основные белки окрашиваются более интенсивно по сравнению с кислыми), однако, вполне возможно, имеет место и тидрофобное взаимодействие. Вследствие этого необходимо определять связывающую способность каждого исследуемого белка.
Методика. Электрофорез проводят в пластине геля; в лунки вносят пробы исследуемого белка (например, 1, 2, ..., 40 мгк); исходную концентрацию белка определяют рефрактометрически, взвешиванием, спектрофотометрически или по данным аминокислотного анализа; гель окрашивают по методике, описанной в разд. 1.2.1.1. Каждый трек сканируют на денситометре при λmах=590—595 нм (λmin = 400 нм). Площадь пика определяют с помощью интегратора или путем взвешивания диаграммной бумаги, ограниченной кривой [61]. В области сохранения закона Бера строят градуировочный график в координатах длина пробега зон — молекулярная масса белка. Окрашивание и обесцвечивание (разд. 1.2.1.2) гелей следует стандартизировать, в противном случае площадь пика на единицу массы белка сильно варьирует для каждого геля. Диссоциированный олигомер следует разделять в том же геле. По результатам анализа диссоциированного олигомера определяют соотношение мономеров по массе. По этому соотношению с учетом молекулярной массы мономеров рассчитывают молярный состав олигомера.