Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Обнаружение соединений при хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента
Обнаружение с помощью нингидрина

Окрашивание нингидрином может быть проведено после обработки флуорескамином. Если в процессе хроматографии использовались кислые растворители, то следует слегка подщелочить реагент слабым основанием, если растворители были щелочными, то рекомендуется подкислить его слабой кислотой.

1. Нингидрин (0,2%-ный раствор в 95%-ном ацетоне) с добавлением нескольких капель коллидина (2,4,6-триметилпиридин) или ледяной уксусной кислоты. После погружения в раствор или опрыскивания сушат хроматограмму при 60 °С, 20 мин или при 100 °С 5—10 мин под наблюдением. Перегрев вызывает образование темного фона, он не возникает, если оставить хроматограмму на 24 ч в темноте при комнатной температуре. Большинство аминокислот дает фиолетовое окрашивание, но имеются исключения (Asp — сине-красное, Pro и Нур — желтое окрашивание). Предел чувствительности ~1 мкг.

2. Необходимы: нингидрин (300 мг), 3 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл н-бутанола. Чувствительность обнаружения 0,001 мкг (для аланина) — 0,1 мкг (для пролина и аспарагиновой кислоты) [107].

3. Необходимы забуференные растворы нингидрина. Нингидрин (300 мг), ледяная уксусная кислота (20 мл) и коллидин (5 мл) разбавляют до объема 100 мл этанолом f 190]. Нингидрин (0,1 масс./об.) в смеси ацетон — уксусная кислота — коллидин (100 : 30 : 4) [42].

4. Нингидрин — ацетат кадмия |148|. В отличие от нингидрина этот реагент дает прочное окрашивание (для всех аминокислот — красное, для пролина — желтое), не выцветающее со временем.

Растворяют 0,5 г ацетата кадмия в смеси 50 мл воды и 10 мл концентрированной уксусной кислоты. Доводят до объема 500 мл ацетоном. К порции этого раствора прибавляют твердый нингидрин до конечной концентрации 0,2%. После опрыскивания хроматограмму нагревают 15 мин при 60 °С. Отмечают пятна аминокислот сразу же и через 24 ч хранения при комнатной температуре. Не возникает окрашенного фона, если хроматограмму после обработки реагентом без нагревания оставляют на ночь в темноте при комнатной температуре. У некоторых соединений (таурин, треонин) окраска проявляется очень медленно. Чувствительность обнаружения — 0,5 нмоль.