Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Количественное определение белка
Определение белка с помощью биуретовой реакции

8.18.3.1. Микрометод [180].

Реагенты.

А. 0,21%-ный раствор CuSO₄∙5H₂O в 30%-ном NaOH, Чтобы предупредить выпадение осадка гидроксида меди этот раствор готовят следующим образом: 21 мл 1%-ного (масс./об.) водного раствора CuSO₄∙5H₂O добавляют к 75 мл 40%-ного NaOH, а затем уже разбавляют водой до 100 мл.

Б. 30%-ный NaOH.

Оба реагента могут храниться в склянках из пирекса в течение 6 мес.

Методика. К 2 мл раствора белка (0,02—0,53 мг/мл) добавляют 1 мл реагента А. Тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре 5 мин, после чего измеряют поглощение при 310 нм против «холостого» опыта. Готовят следующие смеси:

Х₁ — 2 мл раствора белка+1 мл реагента А;

Х₂ — 2 мл дистиллированной воды+1 мл реагента А;

Y₁ — 2 мл раствора белка+1 мл реагента Б;

Y₂ — 2 мл дистиллированной воды+1 мл реагента Б.

Поглощение белка равно (X₁—X₂) — (Y₁—Y₂); используют градуировочный график.

Замечание. Этот метод — модификация предложенного ранее [417]; методика может быть использована в присутствии ДНК. ДНК в концентрации до 0,7 мг/мл в реакционной смеси не мешает определению, т. е. допустимо соотношение ДНК : белок ≥10 : 1.

Окраска развивается менее чем за 5 мин и сохраняет стабильность 2,5 ч (для семи изученных белков); в случае лизоцима наблюдалось за это время падение интенсивности окраски на 11%. Чувствительность составляет 1/16 чувствительности метода Лоури, но существенное преимущество состоит в том, что зависимость поглощения от количества белка линейна, а влияние природы белка менее существенно. На реакцию не влияет присутствие в растворе NaCl (1,5 М), ацетата натрия (0,1 М), формиата натрия (0,75 М), хлорной кислоты (0,67 М) или Na₂Н-фосфата (0,01 М). При концентрации мочевины >2,0 моль/л требуется ввести небольшую поправку на поглощение мочевины.

Предложен интересный метод, в котором белок обрабатывается сначала биуретовым реагентом, а затем реагентом Фолина. Получена хорошая воспроизводимость результатов (±2% для концентрации белка 50—600 мкг/мл). В координатах Хилла [284] кривая поглощения от концентрации белка преобразуется в прямую.

8.18.3.2. Биуретовый метод для образцов, содержащих тиолы [291].

Реагент. Растворяют 3,9 г CuSO+5H₂O и 6,7 Nа₂-ЭДТА в 700 мл дистиллированной воды. Добавляют при постоянном перемешивании 200 мл 20%-ного NaOH до конечного объема 900 мл.

Методика. Раствор, содержащий 50—1000 мкг белка, в пробирке разбавляют до объема 0,1 мл, добавляет 1,0 мл биуретового реагента, инкубируют 5 мин при 60 °С и измеряют поглощение при 545 нм.

Замечание. Метод не очень чувствителен (— 50 мкг), но прост и дает линейную зависимость поглощения от концентрации вплоть до 1000 мкг белка. Окраска стабильна в течение не менее 1 ч. Добавление иодоацетамида (12,5 мкг) необходимо для исключения влияния больших количеств дитиотреита. Реагент ЭДТА [66] превосходит по хелатирующей способности тартрат [129], что позволяет полностью исключить влияние сульфгидрильных соединений.

Комплекс меди с диэтилдитиокарбаматом в присутствии дезоксихолата давал линейный график для БСА при концентрации белка до 500 мкг/мл [185].

8.18.3.3. Биуретовый метод в применении к образцам, содержащим детергенты [393].

Реагент. 1,5 г CuSO₄∙5H₂O + 4,9 г дигидрата Nа₂-тартрата + 7,5 г NaOH в 1 л воды. Реагент стабилен в течение 4 мес при хранении в пластиковом сосуде при комнатной температуре.

Методика. К 2,5 мл биуретового реагента добавляют 0,5 мл раствора, содержащего 0,2—0,4 мг белка и 2% детергента. Смешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют поглощение при 540 нм против 0,5 мл 2% раствора детергента.

Модифицированный реагент позволяет избежать помутнения раствора в случае присутствия детергентов, используемых для экстракции белков. Для БСА в диапазоне 0,4—8 мг/мл сохраняется линейная зависимость поглощения от содержания белка.

8.18.3.4. Биуретовый метод в применении к образцам, полученным экстракцией тканей [24].

Методика. Используется реагент, описанный в разд. 8.18.3.3 [393.]

Водный экстракт тканей промывают 3 мл смеси ацетон — петролейный эфир (1:1) при температуре 35—60 °С с перемешиванием на вибраторе 30 с. Центрифугируют и декантируют. К остатку добавляют 0,1 мл 10%-ного дезоксихолата (pH 8,0) и 2,9 мл реагента. Закрывают пробирку парафильмом и смешивают растворы, переворачивая осторожно пробирку. Озвучивают дважды по 15 с при 20 кГ источником ультразвука Branson Sonifier. Для максимального развития окраски помещают пробирку в кипящую водяную баню на 30 с. Охлаждают до комнатной температуры и измеряют поглощение при 540 нм против контрольного раствора реагентов.