Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Количественное определение белка
Определение белка с помощью кумасси бриллиантового голубого

8.18.4.1. Метод Бредфорда [38].

Реагент — раствор красителя. Растворяют 100 мг кумасси бриллиантового голубого G-250 (фирма Sigma) в 50 мл 95%-ного этанола. К раствору добавляют 100 мл фосфорной кислоты (85%, масс./об.) и доводят до 1 л дистиллированной водой. Фильтруют. Хранят при 20 °С в течение 2 нед. Реагент поставляют фирмы Bio-Rad и Pierce.

Методика. Раствор белка (10—100 мкг) помещают в пробирку (12Х100 мм) и разбавляют до 0,1 мл 0,15 М раствором NaCl. Добавляют 5 мл раствора красителя и перемешивают на вибромешалке. Через 2 мин начинают снимать кривую поглощения (при 595 нм) против контрольного раствора (0,1 мл соответствующего буфера-М мл раствора красителя); измерения продолжают в течение —1 ч.

Можно работать с пробами, содержащими 1 —10 мкг в 0,1 мл буфера; при этом добавляют 1 мл раствора красителя. Измерение проводят в кювете объемом 1 мл.

Кюветы следует промывать соответствующим детергентом, водой и ацетоном для удаления комплекса белка с красителем, образующим пленку на стеклянной поверхности, или вымачивать в течение ночи в 0,1 М НСl.

Замечание. Описанный метод характеризуется в — 4 раза более высокой чувствительностью, чем метод Лоури. Окраска стабильна (±4%) в течение 1 ч. Катехоламины (как и хлориды натрия, калия, магния, сульфат аммония, этанол) не мешают определению, что позволило применить его к анализу фракций белков надпочечников [306]. В незначительной степени на результаты оказывают влияние буферные компоненты со щелочными свойствами, трис, уксусная кислота, 2-меркаптоэтанол, сахароза, глицерин и следовые количества детергентов; это влияние может быть компенсировано путем введения соответствующих добавок в контрольный раствор. Более подробно о мешающих корректному определению белка соединениях см. работу [350].

Достоинства метода Бредфорда заключаются в быстроте анализа и воспроизводимости результатов, но не всегда графики зависимости поглощения при 595 нм от количества белка линейны и угол наклона кривой для разных белков сильно варьирует [289, 377]. Поэтому график, полученный для белка-стандарта, может быть неприменим без соответствующих поправок к неизвестному белку. Наиболее достоверные результаты [303] дает измерение поглощения белка при 280 нм (при концентрации белка >50 мкг/мл) или 205 нм (при концентрации белка <50 мкг/мл).

При тщательном изучении метода Бредфорда [350] было найдено, что коэффициент экстинкции комплекса краситель белок остается постоянным при концентрации белка 0,8—10 мкг/мл, поэтому рекомендуется выбирать объем раствора красителя (0,5—5,0 мл) таким образом, чтобы конечная концентрация белка оказывалась в указанных пределах. Это обеспечивает выполнение закона Бера (линейность зависимости) и позволяет осуществить точное определение белка при содержании 0,5—50 мкг.

Белки в концентрации менее 2 мкг/мл определялись с помощью кумасси R (фирма Sigma). Белок осаждали на стеклянно-фибровый диск, промывали трихлороуксусной кислотой, обрабатывали реагентом кумасси и образовавшийся окрашенный комплекс растворяли в метанольном растворе NaOH для колориметрического определения при 590 нм [249]. Применение щелочи, рекомендуемое для снятия осажденного белка с подложки, улучшает последующее колориметрическое или радиометрическое измерение [101].

Метод Бредфорда может быть применен к белкам, растворенным в электрофоретическом буфере, содержащем ДСН, меркаптоэтанол, трис. В этих условиях БСА дает линейную зависимость (в диапазоне 10—90 мкг белка), аналогичную получаемой в методе Лоури; в применении к анализу клеточных гомогенатов оба метода дали воспроизводимые, но различные по углу наклона графики [323].

8.18.4.2. Микровариант метода Бредфорда [46]. Образцы белка по 100 мкл (например, фракции элюата с ВЭЖХ) или растворы белков-стандартов помещают в ячейки плашки для микротитрования, приливают к ним по 200 мкл раствора красителя, разбавляют водой (1 :5). Энергично встряхивают и через 10 мин измеряют поглощение при 595 нм (спектрофотометр фирмы Titertek Multiskan, фильтры фирмы Flow Labs. Inc.).