Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Окрашивание белков на нитроцеллюлозной бумаге
Обнаружение с помощью антител

Перенесенные на нитроцеллюлозные пластинки белки обрабатывают 2,4-динитрофторобензолом. Образующиеся производные белка могут быть обнаружены в количестве 10 нг при обработке антителами к динитрофенильным. (ДНФ) группам с помощью пероксидаза-антипероксидазного комплекса. Метод в 100 раз более чувствителен, чем окрашивание кумасси, и в то же время лишен осложнений, возникающих при использовании комплекса серебра.

Реагенты.

A. 50 мМ NaHC0₃ в 50%-ном диметилсульфоксиде.

Б. 0,14 М NaCl, забуференный 10 мМ Na-фосфатом, pH 7,2.

B. 3%-ный БСА—10%-ный раствор инактивированной нагреванием сыворотки теленка в 0,14 М NaCl, забуференном 10 мМ Na-фосфатом pH 7,2.

Г. 50 мМ трис — НСl-буфер (pH 7,5), содержащий 0,3 мг/мл 3,3'-диаминобензидина и 0,005% Н₂О₂.

Методика.

1. Выдерживают нитроцеллюлозную пластинку 10 мин при комнатной температуре в реагенте А, содержащем 0,00001—0,1% 2,4-динитрофторобен- зола. Более длительное время инкубации и более высокая концентрация реагента могут усложнить удаление его избытка. Промывают несколько раз реагентом А. Антигенные детерминанты определяются по методу [368], как описано ниже.

2. Промывают реплику реагентом Б (пять раз по 5 мин).

3. Выдерживают при легком встряхивании в течение 1 ч при 40 °С в реагенте В.

4. Инкубируют в течение ночи в антисыворотке кролика к ДНФ-группам, разбавленной (1:200) реагентом В.

5. Промывают пластинку реагентом Б (4 раза по 5 мин).

6. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре с антителами козы, к IgG кролика (фирма Serasource), разбавленными (1:40) реагентом В.

7. Промывают реагентом Б (4 раза по 5 мин).

8. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре с комплексом пероксидаза-антипероксидаза (фирма Miles), разбавленным (1:40) реагентом В.

9. Промывают реагентом Б (3 раза по 5 мин).

10. Погружают в реагент Г для обнаружения пероксидазион активности.