Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Окрашивание белков на нитроцеллюлозной бумаге
Обнаружение с помощью комплекса серебра и антител

Полосы белков с гелей переносят на нитроцеллюлозную бумагу и окрашивают комплексом серебра. В этих условиях сохраняются антигенные детерминанты и индивидуальный белок может быть обнаружен по реакции со специфическими антителами с использованием блоттинга [416].

Электроперенос белков на нитроцеллюлозу. После разделения с помощью электрофореза по Леммли [207] перенос белков на нитроцеллюлозную бумагу осуществляется следующим образом. Нитроцеллюлозную бумагу смачивают в электрофоретическом буфере (24 мМ трис+192 мМ глицин+20%-ный меркаптоэтанол, pH 8,3) и затем кладут на гель. Образовавшийся «сандвич» гель — нитроцеллюлоза между двумя слоями бумаги ватман 3 ММ (также предварительно смоченной) помещают в электроблот (фирма Е-С Apparatur) так, чтобы гель располагался со стороны катода, а нитроцеллюлозная бумага — со стороны анода. Перенос проводят в течение 4 ч при 5,0 Вт и непрерывной циркуляции буфера.

Окрашивание солями серебра [281, 253].

1. Нитроцеллюлозную бумагу с белком промывают в течение ночи 0,01 М буфером трис-НС1, pH 7,4.

2. Промывают дважды по 5 мин дистиллированной водой.

3. Вымачивают в 100 мл ферро(II)-цианида калия (0,5%, масс./об.) 5 мин при встряхивании.

4. Ополаскивают дистиллированной водой.

5. Переносят в 100 мл раствора, содержащего 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония и 0,5 мл 37%-ного формальдегида. Встряхивают бумагу в этом растворе 20 мин.

6. Раствор нитратов сливают. Промывают бумагу дважды дистиллированной водой (10 с) и затем еще раз 3 мин свежеперегнанной водой.

7. Оставляют на ночь в 100 мл водного раствора, содержащего 3 г карбоната натрия и 0,25 мл 37%-ного формальдегида.

8. Промывают дважды (в сумме 15 мин) дистиллированной водой.

9. Помещают на 15 мин в 100 мл раствора, содержащего 1,4 мл концентрированного аммиака, 0,07 г NaOH и 0,2 г нитрата серебра.

10. Дважды ополаскивают дистиллированной водой.

11. Помещают в 100 мл раствора, содержащего 5,0 мг лимонной кислоты и 0,019% формальдегида. Белки проявляются в виде светлых полос на желто-коричневом фоне. В том случае, если исходный гель не содержал ДСН, полосы окрашиваются в желто-коричневый цвет и трудно отличимы от фона.

Обнаружение с помощью специфических антител.

Буфер А. 10 мМ трис — НСl (pH 7,5), содержащий 0,05 М NaCl, 2 мМЭДТА, 4% БСА (фракция V) и 0,1% азида натрия.

Буфер Б. 10 мМ трис — НСl (pH 7,5), содержащий 0,05 М NaCl и 2 мМ ЭДТА.

1. Уравновешивают в течение н.очи окрашенную комплексом серебра нитроцеллюлозную полоску в 0,01 М трис — НСl (pH 7,4).

2. Переносят в буфер А и оставляют на 24 ч при встряхивании.

3. Оставляют на 16 ч при встряхивании в свежем буфере А, содержащем соответствующее количество антител.

4. Промывают буфером Б (5 раз по 10 мин).

5. Выдерживают в свежем буфере А, содержащем ¹²⁵I-меченный белок А (фирма Sigma) (2∙10⁵ имп./мин), в течение 3—4 ч.

6. Промывают буфером Б (6 раз по 10 мин).

7. Высушивают на воздухе.

8. Экспонируют с пленкой Kodak (X-Omat AR) с помощью усиливающего экрана при —70°С.