Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Определение белка, присоединенного к твердому носителю
Определение аминогрупп на твердом носителе

8.21.3.1. Пикратный метод.

Реагенты.

Пикриновая кислота 0,1 М в метиленхлориде.

N,N-диизопропилэтиленамин, перегнанный над СаН₂.

Методика. Обрабатывают смолу (—50 мг) на стеклянной воронке (внутренний диаметр 1 см) дважды 2 мл раствора пикриновой кислоты, а затем промывают 40 мл чистого метиленхлорида. Добавляют N,N-диизопропилэтиленамин (2 мл), затем метанол (2 мл) и вновь амин (2 мл), удаляя жидкость каждый раз путем отсасывания. Фракции промывок объединяют и разбавляют 95%-ным этанолом до 250 мл. Измеряют поглощение при 358 им. Для комплекса амин — пикрат ε = 14500.

8.21.2.2. Метод титрования.

Реагенты.

1 М НСl.

10%-ный триэтиламин в диметилформамиде (ДМФ).

Раствор нитрата ртути, оттитрованный по KCl.

Бромофеноловый синий, 1%-ный раствор (масс./об.) в этаноле.

Дифенилкарбазон, 1%-нын (масс./об.) раствор в этаноле.

Методика. Промывают смолу (—50 мг) 20 мл 1 М HCl, затем 40 мл деионизованной воды и 5 мл метанола.

Последовательно промывают 4 мл 10%-ного триэтиламина в ДМФ, 2 мл ДМФ и 4 мл метанола. Разбавляют объединенные промывки 20 мл воды и 80 мл этанола. Добавляют 5 капель бромофенолового синего и подкисляют смесь до образования желтой окраски осторожным прибавлением разбавленной (0,5 М) азотной кислоты. Добавляют 5 капель 1%-ного дифенилкарбазона (индикатор) и титруют стандартным раствором нитрата ртути до появления розового окрашивания, свидетельствующего об избытке ионов ртути.

Замечание. Согласно работе [214], эти две методики оказались наиболее удобными (исследовались 4 методики) для определения аминогрупп на стеклянных шариках с определенным размером пор.

Определение аминогрупп с использованием реакции образования основания Шиффа с салициловым альдегидом с последующим измерением поглощения при 315 нм [62] дает лучшие результаты, чем с помощью 2-гидрокси-1-нафтальдегида [331].