Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и полипептидных цепей
Сшивание олигомера и мономера
Другие типы поперечных связей в белках

В белках встречаются иные типы межмолекулярных связен, с трудом поддающиеся анализу и специфическому расщеплению. Это альдиминная связь (I) в коллагене [172], десмозин (II) и изодесмозин в эластине (могут связывать 4 полипептидные цепи) [67], изопептидные связи между ε-аминогруппой лизина и амидной группой глутамина (ІІІ) в экстрацеллюлярных структурных белках [10, 117] и, по-видимому, ди- (IV) и тритирозины [109].

1.5.2.1. Альдимины. На первой стадии образования межмолекулярных связей в коллагенах происходит окислительное дезаминирование N- и С-концевых остатков лизина и гидроксилизина под действием фермента лизилоксидазы, представляющего собой медьсодержащий металлопротеин. Образующиеся альдегиды аллизин (СН₂)₃СНО и гидроксиаллизин вступают в реакцию конденсации в основном с ε-аминогруппами гидроксилизина с образованием дегидрогидроксилизилнорлейцина (І) или дегидродигидроксилизилиорлейцина. Альдимины восстанавливаются по двойным связям с помощью борогидрида калия, в результате чего поперечная связь приобретает устойчивость к кислотному гидролизу. Однако дигидроксипроизводное лабильно и перегруппировывается в кетоимин гидроксилизил-5-кетонорлейцин (V) [103]. После щелочного гидролиза коллагена, восстановленного борогидридом, выделены и охарактеризованы галактозид- и глюкогалактозилпроизводные этих фрагментов [145].

Обычно с целью идентификации альдиминный фрагмент коллагена вначале стабилизируют путем восстановления (главным образом цианоборогидридом натрия) [147], затем проводят ферментативный гидролиз и выделяют сшитые между собой пептиды. Эти фрагменты несложно идентифицировать, если использовать восстанавливающий агент, содержащий тритиевую метку. После восстановления и кислотного гидролиза коллагенов (из разных тканей) были выделены и идентифицированы гидроксилизилнорлейцин, дигидроксилизилнорлейцин, гидроксимеродесмозин, гидроксиальдольгистидин и гистидилгидроксимеродесмозин [172]. Кроме того, был получен и идеитифицирован гидроксиальдольгистидин (IV) (образующийся из аллизина, гидроксиаллизина и гистидина), который не восстанавливается борогидридом, но устойчив к кислотному гидролизу [81].

Однако еще не решен вопрос, соответствуют ли эти соединения (и ряд других) фрагментам с поперечными связями в нативных белках (и если да, то насколько) или это артефакты и каким образом альдимины превращаются в устойчивые к восстановлению фрагменты в процессе старения организма [103].

Расщепление альдимина [58]. В желатине поперечные святи расщепляются под действием ß-аминопропионитрила. ß-Аминопропионитрил нейтрализуют ледяной уксусной кислотой, добавляют буферный раствор, желатину, с помощью уксусной кислоты устанавливают pH 7,6 (в реакционной смеси

содержится желатины 1—2 мг/мл, ß-аминопропионитрила 1,9 моль/л, уксусной кислоты 1,3 моль/л, трис 1,6 ммоль/л, МgСl₂ 0,8 ммоль/л), добавляют несколько капель толуола, пробирку закрывают и смесь инкубируют при 38 °С в течение 48 ч.

Восстановление цианоборогидридом натрия [74]. Образец диализуют против 0,1 М натрий фосфатного буфера (pH 4,4) в течение 4 ч, добавляют цианоборогидрид натрия (белок : NaBН₃CN = 30 : 1, по массе) и реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем диализуют и высушивают лиофильно.

Восстановление [¹⁵С]цианидом натрия в аммиаке [130]. Этот метод специально разработан для идентификации поперечных связей в фибриллярных белках, поскольку в случае фибрина реакция восстановления борогидридом натрия (при pH 8) идет с низким выходом и плохо воспроизводима. Продукт реакции — аминонитрил или производное аминокислоты, отражающее строение альдимина. Продукты реакции устойчивы к кислотному гидролизу, легко отделяются от аминокислот и хорошо идентифицируются на аминокислотном анализаторе.

Тонко измельченный эластин (10 мг) суспендируют в воде (2 мл), добавляют 2 мг [¹⁴С]цианида натрия (удельная активность 1,1 мКи/мкмоль) и 2 мл 30%-ного аммиака. Затем реакционную смесь (pH 11,5) инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, подкисляют до pH 1 и диализуют против 0,1 М HCl при 4 °С. При модификации альдиминов присутствие аммиака не обязательно. Если вместо аммиака использовать меченный тритием метиламин, полученный альдегид будет содержать двойную метку. Поскольку удельная активность Na¹⁴CN известна, выход можно оценить количественно. Этот метод введения радиоактивной метки неприменим в случае пиридиниевой формы десмозинов.

Расщепление поперечных связей периодатным методом [146]. После восстановления поперечные связи коллагена можно расщепить путем окисления периодатом при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем с помощью борогидрида калия разрушают избыток перйодата, а продукты окисления восстанавливают до пролина и лизина, которые идентифицируют на аминокислотном анализаторе. Если восстанавливающий агент КВН₄ содержит тритиевую метку ³Н, радиоактивная метка распределяется в соответствии с уравнением реакции;

К восстановленному белку в 1 мл нитратного буфера (pH 5,3) добавляют 0,01 М NaІО₄и выдерживают в темноте при комнатной температуре. Спустя 5 мин в реакционной смеси устанавливают с помощью 2 М NaOH pH 7,5 и добавляют КВН₄ (2—5 мг). Инкубируют в течение 30 мин, а затем добавляют 6 М НСl до pH 2.

Выделение пептидов, соединенных поперечными связями [169]. Для выделения пептидов, соединенных поперечными связями, с успехом используют хроматографию на гидроксиапатите. По-видимому, пептиды, сшитые поперечными связями, сохраняют конформацию нативного белка и благодаря этому проявляют большее сродство к гидроксиапатиту. Нативный или восстановленный нерастворимый коллаген (из кожи или костей быка) расщепляют бромоцианом, смесь пептидов растворяют и дополнительно диализуют против стартового буфера (0,001 М Na₂HPО₄, pH 6,8+1 М мочевина+ 0,15 М NaCl) и затем наносят па колонку (1,5X23 см) с гидроксиапатитом (Hypatite С). Проводят элюирование в линейном градиенте фосфатного буфера (в смеситель помещают 450 мл стартового 0,001 М фосфатного буфера; в резервуар 450 мл 0,2 М Na₂HPO₄, pH 6,8, содержащего 1 М мочевины 0,15 М NaCl). После сбора 800 мл элюата элюирование продолжают в экспоненциальном градиенте. Для этого смеситель герметически соединяют с делительной воронкой, содержащей 450 мл более концентрированного буфера (0,8 М Na₂HPO₄, pH 6,8+1 М мочевина+0,15 М NaCl). Элюат собирают по фракциям (объем 5,5 мл), скорость элюирования 60 мл/ч. Фракции, содержащие сшитые пептиды, объединяют, обессоливают диализом против воды и высушивают лиофильно. При восстановлении с помощью NaB³H₄ гидролизата коллагена из костей быка были получены две главные и одна минорная фракции. Материал второй главной фракции имел максимальную молекулярную массу, характеризовался высокой степенью cпирализации и действительно содержал сшитые пептиды.

1.5.2.2. Десмозины. Для идентификации десмозина эластин восстанавливают NaBD₄ в воде или D₂О, аминокислоты разделяют хроматографически или переводят в N-трифтороацетилметиловые эфиры и анализируют масс-спектрометрически [129].

1.5.2.3. Изопептиды. Наиболее известным изопептидным фрагментом, связывающим полипептидные цепи в белках, является N_ε-(у-глутамил) лизин [107, 117]. После полного ферментативного гидролиза белка или смеси пептидов этот фрагмент можно идентифицировать с помощью аминокислотного анализа. На кривой элюирования ему соответствует пик в области изолейцина. Однако полное разрешение достигается лишь в особых условиях, например в буфере с pH 4,8. Относительно возможной роли Nε-(β-аспартил)лизина как сшивающего фрагмента см. работу [92].