Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Энантиомерный анализ смеси аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Введение

С. ВАЙНШТЕЙН (S. WEINSTEIN, Department оf Organic Chemistrif, The Weizmann Institute of Science. Rehovet, Israel), M. X. ЭНГЕЛ (M. H. ENGEL, School of Geology and Geophysics, The Unicersitу of Oklahoma, Norman, OK 73019, U.S.A.), II. Э. ХАРЕ (P. E. HARE, Geophysical Laboratory, Carnegie Institution of Washington D.C., U.S.A.)

Разделение аминокислот па оптические изомеры методами хроматографии высокого разрешения представляет большой интерес во многих областях исследования. Развивалось эго направление энантиомерного анализа в нескольких лабораториях параллельно с совершенствованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Было предложено проводить разделение аминокислот на энантиомеры на полистирольных |2| и полиакриламидных |6] матрицах с ковалентно присоединенными к ним хиральными лигандами, образующими комплексы с ионами двухваленной меди. Тот же принцип — ионы металла в комплексе с хиральными лигандами, но в подвижной фазе — был использован позднее в обращенно-фазовой хроматографии [4]. Описан эффективный и высокочувствительный метод анализа изомеров аминокислот в системе, где подвижной фазой служит водный раствор, содержащий комплекс Cu (II)-L-пролин, а стационарной фазой — катионообменная смола или силикагель с обращенной фазой. Однако таким способом осуществить полное разделениe на энантиомеры всех аминокислот не удалось [3, 5], оно было достигнуто па их дансильных производных в двухколоночной системе [8].

Дальнейший прогресс в этой области связан с синтезом серин N,N-диалкиламинокислот и их применении в комплексах с ионами Cu (II) в качестве хиральных фаз [9, 10]. В приведенной ниже методике методом ОФ-ВЭЖХ на хиральном комплексе N,N-ди-н-пропил-L-алаyиyацетат меди (Cu-ДПА) удалось разделить на энантиомеры все белковые аминокислоты. Для улучшения разрешения хроматографию проводят в две стадии. На первой стадии смесь аминокислот предварительно разделяется на группы па катионообменной колонке в условиях, аналогичных используемым в обычном аминокислотном анализаторе, но в летучих буферах. Затем после упаривания растворителя каждая группа подвергается энантиомерному анализу на ОФ-колонке с хиральной подвижной фазой. Обработка компонентов смеси после выхода с колонки о-фталевым альдегидом в присутствии меркаптоэтанола (ОФА-реагент) позволяет обнаруживать по флуоресценции субнаномолярные количества аминокислот. Пролин не реагирует с ОФА и может быть идентифицирован по реакции с пипгидрином [7]. Анализ цистеина и цистина проводится после их окисления до цистеиновой кислоты, которая в описываемой методике хорошо разрешается с другими аминокислотами.