Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Энантиомерный анализ смеси аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
ВЭЖХ
Разделение на группы

Аминокислоты делят на 4 группы:

1) кислые: Суа, Asp, Thr, Ser, Glu;

2) нейтральные: Gly, Ala, Val, Met, Leu, Ile;

3) ароматические: Phe, Tyr, Trp;

4) основные: Lys, His, Arg.

Вносят 20 мкл раствора аминокислот на колонку из нержавеющей стали (50x4,6 мм) с катионообменной смолой (5 мкм) типа полистиролдивинилбензолсульфокислота, уравновешенную буфером I. Первые три группы аминокислот, за исключением Тrр, элюируют этим же буфером. На рис. 9.1 приведена хроматограмма и условия разделения. Буфер II используют для элюирования Trp, Lys, His и Arg. Элюат с колонки смешивается с ОФА-реагентом, поступающим со скоростью 0,6 мл/мин, и попадает в реакционную ячейку в виде спирали (для завершения реакции достаточно времени прохождения спирали), а затем в флуоресцентный детектор (Waters, 420 АС). Первый прогон позволяет установить точные времена удерживания аминокислот. Затем процедуру повторяют в идентичных условиях, но без обработки компонентов реагентом и детектирования полученных производных. Аминокислоты собирают непосредственно на выходе с колонки в определенные временные интервалы, например кислые аминокислоты между 1 и 9 мин, нейтральные — 10—15 мин, другие аминокислоты — по отдельности, чтобы избежать больших объемов буферов (Phc 20—24 мин; Туr 34—38 мин; Тrр 62—66 мин, Lys 75—81 мин, His 84—89 мин, Arg 175— 188 мин). Фракции Тrр, Туr и Phe объединяют; также поступают с фракциями His, Lys и Arg.

Для сокращения времени разделения исходная смесь аминокислот может быть разделена па колонке (50x2,0 мм) с использованием только буфера II (сразу от старта). Это приводит к более быстрому элюированию Тrр, Lys, His и Arg. Все остальные аминокислоты элюируются совместно и далее могут быть разделены в буфере I.

Фракции элюата по группам аминокислот упаривают в токе азота и затем в течение 20 мин сушат в вакууме. Остаток растворяют в 200 мкл хиральной подвижной фазы для следующей стадии разделения.