Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Энантиомерный анализ смеси аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
ВЭЖХ
Энантиомерный анализ

Аликвоту каждой фракции (20 мкл) вносят в колонку из нержавеющей стали (150X4,6 мм) с обращенной фазой Сферисорб ЛС-18 и хиральной подвижной фазой, где индивидуальные аминокислоты разделяются на d- и L-изомеры. В случае необходимости к элюенту добавляют ацетонитрил для уменьшения времени удерживания. Определение аминокислот в элюате осуществляется так же, как па стадии катионообменной хроматографии. Времена удерживания приведены в табл. 9.1.

Хроматограммы и условия разделения энантиомеров четырех групп аминокислот приведены па рис. 9.2—9.5. На специальных образцах, обогащенных L- и D-формами, показано, что во всех случаях без исключения D-изомер сходит с колонки раньше L-изомера.

Кислая (Ser, Thr, Суа, Asp, Glu) и основная (Lys, Arg, His) группы элюируются водным раствором, содержащим хиральную добавку. Для группы, состоящей из нейтральных аминокислот (Gly, Ala, Val, Met, Leu, Ile), к подвижной фазе добавляют ацетонитрил (1%) для уменьшения времени удерживания. Третья группа (Phe, Туr, Тrр) элюируется с добавлением 14% ацетонитрила.

Внутри каждой группы достигается полное разрешение энантиомеров всех аминокислот.

РИС. 9.2. Разделение кислых аминокислот (группа 1) на энантиомеры па колонке с обращенной фазой. Подвижная фаза: хиральная добавка (Сu-ДПA) в воде. Температура комнатная: скорость потока 0,1 мл/мин, через 30 мин - 0,2 мл/мин.

РИС. 9.3. Разделение нейтральных аминокислот (группа 2) на энантиомеры па колонке с обращенной фазой. Подвижная фаза: хиральная добавка (Сu-ДПА) в воде и водном ацетонитриле (1%-ный). Температура комнатная, скорость потока 0,25 мл/мин.

РИС. 9.4. Разделение ароматических аминокислот (Туг, Phc и Тrр) на энантиомеры на колонке с обращенной фазой. Подвижная фаза: хиральная добавка (Cu-ДПА) в воде и водном ацетонитриле (14%-ный). Температура комнатная, скорость потока 0,5 мл/мин.

РИС. 9.5. Разделение основных аминокислот на энантиомеры на колонке с обращенной фазой. Подвижная фаза: хиральная добавка (Cu-ДПА) в воде. Температура комнатная, скорость потока 0,2 мл/мин.