Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение аминокислотной последовательности пептидов по методу Эдмана с идентификацией дансиламинокислот
Дансилирование
Методика дансилирования

1. Растворяют пептид в небольшом объеме 1%-ного водного триэтиламина (фирма Pierce, «для секвенирования»). Небольшую аликвоту (~1 мкл, 0,5 нмоль) с помощью калиброванной микропипетки (1—5 мкл) переносят на дно ампулы (при необходимости центрифугируют, чтобы жидкость стекла со стенок). Ампулы для дансилирования (4x50 мм) вытягивают из стеклянных трубок, так чтобы дно их было коническим, и перед употреблением прокаливают в течение ночи при 500—600 °С (гл. 8).

2. Высушивают образец, добавляют 3 мкл раствора бикарбоната натрия (0,2 М) и 3 мкл раствора дансилхлорида (5 мг в 1 мл сухого ацетона), закрывают ампулу парафильмом.

3. Инкубируют 30 мин при 50 °С; контроль по исчезновению желтой окраски дансилхлорида.

4. Высушивают на масляном насосе над гидроксидом натрия.

5. Добавляют 5 мкл 6 М НСl. Пептиды с ожидаемыми N-концевыми остатками карбоксиметилцистеина запаивают в вакууме, а триптофана — в присутствии 1%-ного триптамина и инкубируют при 100°С в течение 6 ч. В альтернативном варианте добавляют 10 мкл смеси конц. НСl — пропионовая кислота (1:1) и выдерживают при 165°С 12 мин.

6. Открывают ампулу (если необходимо, центрифугируют, чтобы капли раствора опустились на дно) и высушивают в вакууме масляного насоса над гидроксидом натрия.

7. Проверяют гомогенность полиамидных пластинок (75Х75 мм или 50X50 мм, Cheng Chin Trading Со., Taiwan) при УФ-облучении.

8. Добавляют 3 мкл 95%-ного этанола к осадку гидролизата и с помощью капилляра наносят раствор на обе стороны пластинки (максимальный диаметр пятна 1 мм). Пятна должны располагаться строго напротив друг друга на расстоянии 6 мм от двух краев. На одну сторону пластинки наносят 0,2 мкл растворов маркеров (0,1 мг/мл ДНС-Phe, ДНС-Рrо, ДНС-Gly, ДНС-Glu, ДНС-Ser, ДНС-Arg).

9. Хроматографируют в двух направлениях, в каждом так, чтобы растворитель проходил 70% длины пластинки (10— 30 мин): в первом направлении в системе 1 (1,5%-ная муравьиная кислота) и после высушивания в токе теплого воздуха во втором направлении (перпендикулярно первому в системе 2 (бензол — уксусная кислота, 9:1). Высушивают и исследуют обе стороны хроматограммы при УФ-облучении. В этой системе растворителей разрешаются пятна всех дансиламинокислот, за исключением пар ДНС-Glu — ДНС-Asp, ДНС-Ser — ДНС-Thr, а также а-ДНС-Lys — ε-ДНС-Lys — ДНС-Arg —ДНС-His. Пятно ДНС-Ala иногда перекрывается пятном дансиламида. Для разделения указанных дансиламинокислот используют системы растворителей 3 и 4. Систему 3 (этилацетат — метанол — уксусная кислота, 20:1:1) применяют в том же направлении, что и растворитель 2, для разделения ДНС-Glu — ДНС-Asp; ДНС-Ser — ДНС-Thr и улучшения разрешения ДНС-Ala и ДНС-NН₂(рис. 11.3). Система 4 (0,05 М тринатрийфосфат — этанол, 3:1; хроматография в том же направлении, как и в системах 2 и 3) служит для разрешения пятен монозамещенных дансильных производных основных аминокислот. Однако четкая идентификация в этом случае не всегда возможна и требуется сравнение с соответствующими маркерами, нанесенными рядом.

10. Полиамидные пластинки могут быть использованы повторно после промывки смесью аммиак — ацетон (75 мл конц. аммиака+ 925 мл воды+ 10 мл ацетона) в течение 1 ч. Металлические держатели для пластинок не должны оставаться в промывном растворе, поскольку возможно образование продуктов коррозии, отлагающихся па пластинках и гасящих флуоресценцию дансильных производных. Перед употреблением качество промытых пластинок надо проверять под УФ-облучением и пластинки, содержащие флуоресцирующие пятна, забраковывать.