Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение аминокислотной последовательности пептидов по методу Эдмана с идентификацией дансиламинокислот
Конденсация и расщепление по Эдману

Для успешного протекания реакции Эдмана (рис. 10.1) необходимо: использование чистых реагентов, исключение кислорода из реакционной среды, полное высушивание пептидов после стадий конденсации и расщепления. Реагенты должны быть свежеперегнанными [2], а реакционная смесь для конденсации — насыщена азотом. Образцы пептидов предварительно тщательно высушивают в нагреваемых в металлических блоках вакуумных эксикаторах.

РИС. 11.3. Ориентировочное расположение пятен дансиламинокислот (заштрихованные пятна) относительно пятен маркеров (темные пятна). Hse — ДНС-гомосерин, Y⁰ — ДНС-Tyr, Y_а⁰ — ди-ДНС-Туr, Кε — ε-ДНС-Lys, Ка — а-ДНС-Lys, К_аε — ди-ДНС-Lys, КаPTC — а-ДНС ε-ФТК-Lys, СМС — ДНС-CMCys, ДНС-ОН-дансиловая кислота, ДНС-NН₂ — амид дансиловой кислоты. Для других ДНС-аминокислот обозначения даны в однобуквенном коде.

Описываемая ниже методика безусловно уступает автоматическим методам как в скорости анализа (не более двух циклов расщепления в день для одного пептида), так и в выходах па стадиях, но она очень удобна для одновременного определения структуры нескольких коротких пептидов. В этом случае трудоемкий процесс насыщения азотом каждого образца в отдельности перед стадией конденсации можно усовершенствовать. Так, автор для этой цели использовал простую конструкцию — трубку с 20 ответвлениями-иглами от шприца (защищенными от коррозии тефлоновыми трубочками). Иглы расположены таким образом, что при опускании в латунный блок для нагревания входят в пробирки с образцами. Вместо завинчивающихся крышек пробирки плотно заклеивают липкой лентой, причем делают это одновременно, используя лист пленки (Perspex) с 20 лунками. Коммерчески доступно устройство, в котором осуществляется и температурный контроль за нагревом образцов в блоке (N-Evap фирмы Organomation).

Для процесса деградации по Эдману необходимы следующие реагенты (перегнанные или марки «для секвенирования») и оборудование: фенилизотиоционат (10%-ный раствор в пиридине, хранят в темноте при —20°С не более одной недели); водный пиридин (1:1, хранят в темноте); трифтороуксусная кислота; этанол (95%-ный); н-бутилацетат, газообразный азот (в баллоне); пробирки (из пирекса), прокаленные при 500— 600°С; термостат с контролируемым нагревом, вакуум-эксикаторы и вакуумная линия к масляному насосу; эксикаторы с пентаоксидом фосфора и гидроксидом натрия (для сушки ФТК-пептидов после стадии конденсации); еще один эксикатор с гидроксидом натрия (предназначен для сушки пептидов после стадии расщепления).