Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение аминокислотной последовательности пептидов по методу Эдмана с идентификацией дансиламинокислот
Конденсация и расщепление по Эдману
Деградация по Эдману. Методика

1. Фенилизотиоцианат, пиридин и трифтороуксусную кислоту хранят в плотнозакрытых сосудах под азотом (насыщение азотом надо повторять до и после использования этих реактивов).

2. 20—50 нмоль пептида высушивают досуха (образец не должен содержать солей).

3. Добавляют 100 мкл 50%-ного пиридина и «продувают» азотом (1 мин).

4. Добавляют 50 мкл 10%-ного ФИТЦ в пиридине и вновь «продувают» азотом (1 мин).

5. Ампулу закрывают и инкубируют в блоке для нагревания при 50 °С (30 мин).

6. Вакуум-эксикатор с пентаоксидом фосфора и гидроксидом натрия помещают в термостат (60 °С).

7. Эксикатор вынимают из термостата и подключают к вакуумной линии для высушивания пептидов.

8. Через 10 мин проверяют, образовался ли твердый осадок (из смеси ФТК-пептида и дифенилтиомочевины) розоватого цвета, если в остатке масло, то добавляют 50 мкл 95%-ного этанола и повторяют операцию высушивания.

9. Осадок растворяют в 50 мкл безводной трифтороуксусной кислоты, закрывают пробирку и инкубируют 15 мин при 50 °С. Если ожидается после расщепления образование N-концевого остатка глутамина, то инкубацию ведут 5 мин (при этом уменьшается вероятность циклизации глутамина в пирролидонкарбоновую кислоту).

10. Пептид высушивают над гидроксидом натрия, в случае необходимости добавляют 50 мкл этанола и снова упаривают.

11. Добавляют 100 мкл деионизованной воды. На вибромешалке тщательно перемешивают с 1 мл бутилацетата и разделяют фазы на настольной центрифуге (5 мин). Органическую фазу удаляют, тщательно контролируя, чтобы не захватить возможный осадок нерастворимого пептида на границе двух фаз. Промывку бутилацетатом повторяют дважды.

12. Водную фазу высушивают и растворяют в 1%-ном триэтиламине. Часть раствора берут на дансилирование, остаток высушивают и проводят следующий цикл деградации по Эдману. Если необходимо прервать процесс, то делают это всегда после стадии расщепления.

Замечание. Для ускорения высушивания образцов можно использовать вакуумную центрифугу (Speed Vac Concentrator фирмы Savant Instruments).