Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Современное состояние автоматического жидкофазного анализа аминокислотной последовательности
Сравнение квадрола с летучими буферами

Со времени появления секвенатора квадрол оставался главной составной частью буферов. Он удовлетворял всем основным требованиям автоматического анализа, но обладал единственным недостатком — для его удаления необходима экстракция реакционной массы растворителями (например, этилацетатом), в которых растворяются некоторые пептиды. Во избежание этого в 70-е годы стали широко использовать летучие буферы на основе ДМАА, N,N-диметилбензиламина (ДМБА) и тому подобных аминов. И только после появления [3] в 1975 г. программы с применением 0,1 М квадрола предложения использовать небелковый носитель — полибрен — и введения в комплект прибора охлаждаемой ловушки буферы на основе квадрола снова оказались приемлемыми.

ДМАА имеет два очевидных преимущества. Во-первых, он лучше квадрола растворяет многие белки. Доказательством этого служат результаты сравнительного анализа многих белков. Во-вторых, летучесть ДМАА позволяет исключить промывку реакционной массы этилацетатом и ограничиться только промывкой бензолом.

Для уменьшения вымывания коротких пептидов при использовании квадрола в реактор вводят полибрен и применяют буферы с низкой концентрацией квадрола.

В табл. 15.1 приведены выходы С-концевой аминокислоты для пяти пептидов, аминокислотная последовательность которых анализировалась в различных условиях: с использованием квадрола или ДМАА, с добавлением или без добавления полибрена.

В графе А представлены результаты, полученные при использовании ДМАА по стандартной «пептидной» программе без каких-либо добавок; в графе Б — результаты анализа с добавлением полибрена. В обоих случаях работа проводилась на одном и том же секвенаторе модели 890С. В графе В приведены данные, полученные на другом секвенаторе с использованием 0,1 М квадрола, в графе Г — с добавлением полибрена после нанесения пептида в реактор. В каждом случае анализировали 10 нмоль пептида. Определение ФТГ-производных аминокислот проводили методом ВЭЖХ. Как следует из приведенных данных, внесение полибрена положительно сказывается на анализе.

Таблица 15.1. Сравнение результатов анализа на секвенаторе с использованием 0,1 М квадрольного буфера, ДМАА-буфера в присутствии и в отсутствие полибрена

^a А — ДМАА (без полибрена); Б — ДМАА (с полибреном); В — 0,1 М квадрол (без полибрена); Г — 0,1 М квадрол (с полибреном). Указан выход С-концевой аминокислоты пептида (наномоль) при загрузке в реактор секвенатора 10 нмоль каждого образца [13].

Существенное преимущество квадрола по сравнению с ДМАА состоит в более высоких постадийных выходах и в отсутствие артефакторов в разных системах идентификации. Квадрол меньше, чем ДМАА, загрязняет вакуумную систему и систему подачи реагентов.

Конструкция секвенатора модели 890С позволяет быстро переходить от одной буферной системы к другой.

От редактора. Для анализа на секвенаторе с вращающимся реактором первоначально требовалось 250 нмоль белка. В настоящее время можно анализировать 100 пмоль (при условии очистки квадрола перед использованием). Очистка уменьшает величину фоновых пиков и позволяет определять более длинные последовательности*.

Коммерческий препарат квадрольного буфера разбавляют до 0,1 М смесью пропанол-1 — вода (3:4). Добавляют 10 мг/мл ß-N-(2-аминоэтил-3-аминопропил)стекла (фирма LKB) и мягко перемешивают в течение 24 ч при 20 °С для удаления следов альдегидов. После отстаивания частиц стекла отбирают буфер пипеткой. Добавляют 2 мг/мл ДИТЦ-β-N-(2-аминоэтил-3-аминопропил)стекла (LKB) к 0,1 М квадролу и мягко перемешивают в течение 4 сут при 20 °С. Хранят буфер над ДИТЦ-стеклом при 20 °С и отбирают его пипеткой по мере необходимости.

* ЖФ-анализ пептидов и белков на пикомольном уровне оказался непосильной задачей для большинства лабораторий. Реально для определения последовательности требуется не менее 1 нмоль образца, что явилось главной причиной вытеснения ЖФ-метода более чувствительным и экономичным ГФ-определением (табл. 17.1). — Прим. перев.