Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Современное состояние автоматического жидкофазного анализа аминокислотной последовательности
Полибрен

«Никто не знает, почему он работает, но он работает». Введение полибрена оказало глубокое влияние на автоматический анализ последовательности [12, 15]. Использованный вначале совместно с ДМАА полибрен в настоящее время широко используется и с 1 М квадролом, и с 0,1 М квадролом, и с буферами, содержащими 1 М и 0,1 М квадрол, в различных пропорциях. Его продает фирма Aldrich и в «очищенном» виде — фирма Pierce (марка «для секвенирования»). Описан ряд методик для дальнейшей очистки полибрена. По опыту нашей лаборатории, продукт фирмы Aldrich удовлетворяет требованиям анализа. Изучая возможности использования полибрена в сочетании с буферами на основе квадрола и ДМАА, мы загружали в реактор 0,3 мг, 3,0 мг, 30 мг и нашли, что доза в 3 мг является наилучшей. Недавние исследования указывают на то, что следует предпочитать пробы в 1 мг, хотя в некоторых лабораториях применяют навески до 10 мг. Примеси, присутствующие в полибрене, не обнаруживаются при хроматографии продуктов отщепления на секвенаторе, если до начала анализа провести один цикл без добавления ФИТЦ. Положение пиков на хроматограмме, соответствующих этим примесям, зависит от источника снабжения реактивами, растворителями и полибреном. Незначительные изменения состава растворителей для ВЭЖХ, свойств колонок разных фирм или даже разных колонок одной фирмы ведет к изменению положения артефактов на хроматограмме. От примесей можно избавиться одним из следующих способов:

1) очистить полибрен перед использованием;

2) нанести его в реактор без пептида (белка) или внести в реактор Gly-Gly, провести несколько циклов отщепления перед добавлением пептида (белка);

3) пептид и полибрен внести одновременно и провести один (или несколько) циклов промывки. Эта методика позволяет удалить большую часть примесей, присутствующих в полибрене. Пики примесей иногда появляются на хроматограммах первых двух-трех циклов отщепления, но они легко отличаются от пиков фона аминокислот тем, что резко уменьшаются в размерах в течение первых трех циклов отщепления.

Полибрен можно долго хранить, тем не менее использование образца, простоявшего при комнатной температуре более недели, часто приводит к недостоверным результатам определения структуры. Поэтому следует ежедневно готовить свежий раствор полибрена или хранить такой раствор при 4 °С не более недели. Можно растворить полибрен в воде (30 мг/мл) и хранить раствор в морозильной камере холодильника.

При использовании полибрена в работе на секвенаторе фирмы Beckman не обнаружено вредного воздействия его ни на систему клапанов, ни на систему идентификации. В лаборатории авторов анализировалось >20 000 образцов ФТГ-производных аминокислот методом ВЭЖХ и (или) обратного кислотного гидролиза с последующим определением аминокислот па анализаторе D-500 фирмы Durrum без вредного воздействия на аппаратуру.