Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Новейшие методы твердофазного и жидкофазного определения аминокислотной последовательности
Твердофазный анализ. Новейшие подходы
Носители

Твердофазные определения проводят почти исключительно на пептидах, ковалентно присоединенных к модифицированным матрицам одного из трех типов:

1) полистирол (1% поперечной сшивки дивинилбензолом);

2) пористое стекло;

3) производные полиакриламида.

Описаны методы получения и свойства этих носителей [70].

Идеальная матрица, предназначенная для иммобилизации пептидов, должна обладать следующими свойствами:

1) низким сопротивлением потоку в колонке, что обеспечивается как высокой механической прочностью частиц, так и минимальным изменением объема носителя в колонке в течение всего цикла отщепления;

2) химической стойкостью;

3) высоким значением удельной поверхности, легко доступной окружающей жидкости;

4) химической емкостью поверхности частиц сорбента, достаточной для эффективного присоединения пептида;

5) кинетические условия реакций пептидил-носителя должны приближаться к кинетике реакций в растворе.

Ни один из известных сегодня носителей не удовлетворяет одновременно всем вышеупомянутым критериям. Слабосшитые полистирол и полиакриламид должны предварительно хорошо набухнуть в растворителе для того, чтобы функциональные группы носителя или пептида, присоединенного к носителю, были доступны для реагентов. Поэтому при работе с такими сорбентами очень важен выбор растворителей. При смене растворителей часто происходит «усадка» или разбухание этих гелеобразных полимеров, что ведет к образованию каналов или же «запиранию» колонки. Для предотвращения этих явлений частицы пептидил-полимера тщательно смешивают с гораздо большими объемами маленьких стеклянных шариков. Однако увеличение общего объема реакционной массы требует применения большего расхода реагентов и промывающих растворителей, ведет к сорбции реагентов и побочных продуктов реакции. Соответственно возрастает уровень фона в анализируемых образцах, что может стать серьезным препятствием для анализа на микроуровне.

В противоположность этому пористые стекла обладают жесткой структурой и не вносят упомянутых проблем. Поэтому при работе с ними можно применять широкий набор растворителей без риска появления в колонке высокого давления (при условии, что в ходе присоединения пептида удалось избежать механического повреждения хрупких частиц, так как размол крупных частиц до мелких приводит к созданию больших противодавлений при последующей работе колонки).

К сожалению, стекло до некоторой степени растворяется в щелочной среде, поэтому не следует использовать растворы, имеющие рН>8,5:9,0.

Несмотря на недостатки, присущие носителям па основе стекла, применение последних позволяет успешно проводить определение последовательности.

Низкосшитый полистирол является неудачной матрицей для пришивки белков и очень больших пептидов. Часто встречающаяся несовместимость растворителей и пептидов (или матрицы) приводит к изменениям структуры пептидилносителя, неблагоприятным для доступа реагентов к N-концевым аминогруппам. Для решения этой проблемы применяли матрицу на основе полиакриловой кислоты, амидированной сульфонированным n-фенилендиамином [20]. Полученные при дальнейшей модификации полимера изотиоцианатные группы используют для присоединения белка, а соседние ионы сульфоната создают местное гидрофильное окружение, необходимое для совместимости с растворителями.

Все обычно применяемые носители имеют элементы структуры, вносящие свой вклад в создание химического фона, и поэтому для снижения уровня фона необходима химическая модификация носителя. Поскольку постадийные выходы редко превышают 95%, то, очевидно, эти структуры вносят существенный вклад в неидеальную кинетику реакций.

Дальнейшие успехи в создании носителей зависят от уровня понимания природы химических реакций в многофазных системах. Необходимо отказаться от представления о том, что твердый носитель представляет собой инертную «стенку», к которой прикреплен пептид. Исследования в области твердо- разного синтеза пептидов в настоящее время опираются на концепцию динамической системы носитель — пептид — растворитель, подчиняющейся различным правилам кинетики и термодинамики [35]. Неидеальная кинетика реакции зависит не столько от замедленной диффузии или массопереноса внутрь гранулы, сколько от плохой сольватации пептида и матрицы носителя [39]. Возможно, на сольватацию существенно влияет локальное расслаивание внутри фаз. В определенном микроокружении пептид и матрица могут взаимодействовать настолько сильно, что это взаимодействие становится равнозначным осаждению, приводящему к выводу вещества из реакции.

В других случаях происходит распределение реагентов в системе жидкость — жидкость. По этой причине концентрация реагента в микроокружении N-концевой части пептида особенно мала. Этой проблемы легко избежать, используя систему с одним растворителем [80]. Местные перераспределения, происходящие по любому из вышеупомянутых механизмов, возникают в ходе последовательного отщепления и вызывают временное или постоянное снижение реакционной способности отдельных цепей. Этот недостаток усиливается при наличии заведомых негомогенностей в структуре матрицы (неравномерное распределение поперечных сшивок и т. д.). В результате химической модификации пористого стекла образуется поверхность, покрытая тонкой пленкой поперечно-сшитого силоксанового полимера, а не цепь, присоединенная к сорбенту в одной точке. Поэтому в случае носителей на основе стекла должны существовать те же местные «барьеры» для реакций, что и в гелевых структурах полимеров.

Есть несколько сообщений о получении, свойствах и использовании в твердофазном пептидном синтезе акриловых сополимеров, состоящих главным образом из поли-N,N-диметилакриламида [23, 95, 96] или поли-N-акрилпирролидона [93, 97]. Эти полимеры совместимы с гораздо большим числом полярных и умеренно полярных растворителей (и, по-видимому, также с присоединенными пептидами), чем полиакриламидные или полистирольные носители. Поэтому представляется заманчивым использовать указанные полимеры в качестве носителей для: ТФ-анализа пептидов. Выбирая носитель, мы ориентируемся прежде всего на жесткую конструкцию матрицы, что позволяет избежать серьезных осложнений, связанных с разбуханием сорбента и блокированием колонки. Для того чтобы можно было проводить реакцию присоединения ФИТЦ в сильнощелочной среде, мы выбрали вместо стеклянных носителей макропористый полистирол. Дополнительное достоинство полистирола состоит в том, что на нем можно устойчиво и воспроизводимо проводить многочисленные реакции химической модификации. Выяснилось, что эта жесткая, сильносшитая матрица тем не менее обладает некоторой гибкостью на молекулярном уровне и обеспечивает большой набор микроокружений (включая неблагоприятные) в структуре гидрофобных поверхностей.

Нашей первой целью было введение «вставок» («ножек»), выступающих из поверхности с функциональными аминогруппами, необходимыми для последующего присоединения пептидов. Если «вставки» являются полимерами необходимого размера и состава, то они могут служить также сорастворителями и содействовать образованию отделенной от матрицы фазы, в которой совместимы пептид и используемые растворители. В принципе можно найти условия, позволяющие обеспечить и необходимую степень сольватации всех пептидных цепей и требуемую степень взаимодействия последних с реагентами. В качестве пространственно модифицирующего полимера был выбран полиэтиленгликоль, найденный опытным путем как сорастворитель при ТФ-анализе [87, 88]. Успешно проведен пептидный синтез с последовательным наращиванием пептидной цепи, присоединенной к концам цепей полиэтиленгликоля [79]. При этом кинетика присоединения схожа с наблюдавшейся в свободном растворе [9].

Производные макропористого полистирола были синтезированы по методике, подробно описанной в работе [51]. Сообщалось о предварительных результатах анализа последовательности [1].

Обнаружено, что эти носители хорошо проницаемы для растворителей и обладают низким уровнем фона примесей. Однако в ходе последующего сравнительного расщепления по Эдману пептидов, присоединенных к коротким вставкам, и тех же пептидов, «пришитых» к небольшим цепям полиэтиленгликоля (содержащим до 13 оксиэтиленовых звеньев), не было обнаружено значительных различий ни в начальных, ни в постадийных выходах ФТГ-производных аминокислот. Мы пришли к выводу, что в данном случае для создания эффекта сорастворения или предотвращения сильных взаимодействий полистирол — пептид необходимо увеличение либо навески образца, либо молекулярной массы модифицированного полимера.

В заключение следует отметить, что вероятным идеальным носителем может быть такой привитой сополимер, в котором -один компонент служит жестким каркасом, поддерживающим структуру второго сополимера, к которому ковалентно присоединен пептид. Полимер с жестким каркасом из-за сложностей, вызываемых характером его поверхности, сам по себе был бы ненадежным «якорем» для конденсации с пептидом. Второй компонент следует выбирать с учетом его совместимости с различными растворителями и реагентами, используемыми как для присоединения пептида, так и для определения строения последнего. Сам по себе этот сольватируемый полимер из-за своей совместимости с растворителями и доступности внутренней структуры был бы по механическим свойствам непригоден для использования в колонке. Суммируя вкратце вышеизложенное, следует сказать, что упомянутая макропористая система о жестким каркасом является пелликулярной конструкцией, успешное использование которой зависит от правильного выбора привитого сольватируемого полимера.