Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Новейшие методы твердофазного и жидкофазного определения аминокислотной последовательности
Твердофазный анализ. Новейшие подходы
Присоединение пептидов к носителям и «забивка» оставшихся реакционных центров носителя

ТФ -подход порождает свои проблемы, возникающие из необходимости фиксировать пептид на носителе (обычно при помощи ковалентных связей). Хотя пептиды можно связать и адсорбционными силами, такая иммобилизация не надежда, так как жидкофазное элюирование, происходящее минимум один paз в каждом цикле отщепления аминокислоты, может привести к вымыванию и потере пептида. Для надежной адсорбции необходим тщательный подбор хорошо сочетающихся между собой пептидных образцов и адсорбирующих поверхностей. При множественных и очень прочных адсорбционных связях затрудняется сольватация и понижается подвижность пептидов и тем самым ухудшается кинетика реакции (разд. 16.2.2 — обсуждение носителей). С учетом этих потенциальных недостатков был разработан и успешно использован в миниатюризованном секвенаторе носитель, представляющий собой стекловолокнистый диск, покрытый полибреном [42]. Исследуемый образец адсорбируется на диске (гл. 17). Сообщается об успешном использовании такого носителя при изучении структуры большого числа пептидов и белков (определена последовательность, включающая >30 остатков).

Потеря пептидов сводится к минимуму вследствие их сорбции на большой площади поверхности носителя и использования наиболее полярных реагентов (триметиламин и ТФУ) в газообразном состоянии.

При проведении ковалентного присоединения возникают многочисленные осложнения. Кроме того, не существует удовлетворительного общего способа присоединения пептидов исключительно по их С-концевым остаткам.

В особых случаях можно использовать несколько отлично зарекомендовавших себя вариантов присоединения по а-карбоксилу, широко применяющихся па практике. Эти частные приемы присоединения, а также несколько общих методов конденсации, но не по концевым аминокислотам, обсуждались в работах [64, 106], а также в данной книге (гл. 12).

Прямое присоединение пептидов к носителю происходит по бимолекулярному механизму. При конденсации очень малых количеств пептида высокий выход реакции возможен только при очень высокой эффективной концентрации нуклеофильных групп носителя (обычно это аминогруппы). Поскольку последние присутствуют в большом молекулярном избытке, то кинетически возможна реакция псевдопервого порядка. Однако концентрация аминогрупп пептида мала, и поэтому не требуется их защита в ходе присоединения (за исключением особых случаев [64]). Аминогруппы следует блокировать в тех случаях, когда перед добавлением носителя пептид предварительно активируется. При одностадийных присоединениях редко нужна защита N-концевых групп. Если же она все-таки необходима, то при помощи 2-трет-бутилоксикарбонилоксиимино-2-фенил- ацетонитрила [1] вводят 2-трет-бутилоксикарбонил (БОК) группу [1]. Аналогичная защита аминогруппы нужна и перед активацией карбоксильных групп карбодиимидом при конденсации по С-концевому карбоксилу [85], когда при последующей инкубации в щелочных условиях карбоксильные функции боковых цепей аминокислот превращаются в стабильные N-ацилмочевипы, а часть активированных С-концевых аминокислот — в реакционноспособные оксазолиноны.

При обычных условиях активация пептида карбодиимидами приводит к конденсации его с носителем через карбоксильные группы боковых цепей пептида. В ходе дальнейшего определения последовательности аминокислот могут возникнуть пропуски последовательности в тех местах, где остатки карбоксилсодержащих аминокислот количественно присоединены к носителю за карбоксильные группы боковых цепей. Если данные остатки не являются последними в цепи и за ними существуют другие точки присоединения к носителю, то определение структуры пептида можно продолжить. При конденсации в мягких условиях сохраняются свободные боковые карбоксильные группы некоторых внутренних остатков Asp или Glu. Известно много примеров анализа структуры пептидов, когда удавалось проводить идентификацию остатков Asp (Glu), расположенных внутри молекулы пептида и имевших свободные карбоксильные группы боковых цепей. Например, ТФ-методом определена аминокислотная последовательность большого числа таких коротких пептидов после их присоединения к аминополистиролу при pH 5,0 при помощи водорастворимого карбодиимида [67]. Эта методика основана на работе [109] с некоторыми доработками. Таким образом, проблему присоединения по боковым цепям в целом можно решать термодинамически и (или) статистически, тщательно регулируя выход на стадии конденсации пептида.

Описан усовершенствованный вариант присоединения белков к пористым стеклянным шарикам, активированным ДИТЦ [22].

В этой же работе предложена иммобилизация больших пептидов по остаткам His и Туг на диазотированных ариламиноносителях или по остаткам Cys — на иодоацетамидированных стеклянных шариках. Разработаны способы присоединения пептидов или промежуточных соединений, несущих аминогруппу, к носителю посредством сложноэфирной связи [14].

Иногда карбодиимиды используют в комбинации с активирующими добавками, способствующими образованию сложно-эфирной связи (например, N-гидроксисукциимид или 1-гидроксибензотриазол) [1, 28, 64]. Быстрое образование активных сложных эфиров препятствует появлению неактивных N-ацилмочевин. Для обеспечения необходимой скорости реакции карбодиимиды и активирующие добавки должны присутствовать в большом избытке, но при этом они могут реагировать, друг с другом, давая нежелательные побочные продукты, что наблюдалось в случае совместного использования дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) [38, 69] и N-гидроксисукцинимида [55].

В последнее время в пептидном синтезе стали использовать новый активатор — N-гидрокси-5-нонборнен-2,3,-дикарбоксиимид, который оказался очень устойчивым в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) [37]. Этот активатор может быть с успехом использован в ТФ-присоединениях; в дополнение ко всему сказанному он растворим как в воде, так и в органических растворителях.

Недавно предложен простой и удобный метод активации карбоксильной группы пептида перед его иммобилизацией. При растворении и выдерживании пептида в смеси ТФУ и ангидрида ТФУ, по-видимому, образуется смешанный ангидрид. Затем удаляют легколетучие соединения. Активированный пептид растворяют в ДМФА, добавляют аминокислоту. Предварительное растворение образца в ТФУ облегчает последующее растворение в ДМФА [70]. Выходы стадии присоединения малых и средних по размерам пептидов колеблются от 55% до 98%; высокие выходы свидетельствуют о том, что трифтороацетильная группа является легко уходящей [66]. При обработке пептидов, содержащих Gin, может произойти частичное дезамидирование последнего, а в случае пептидов, содержащих Asp, возможно 'образование циклических имидов. Вышеуказанные проблемы можно сделать менее острыми, если найти способ активации только части карбоксильных групп. Возможно, затем удастся провести селективную активацию С-концевых остатков с образованием промежуточных оксазолинонов.

Для усовершенствования ДИТЦ-метода присоединения лизилсодержащих триптических пептидов предложен гетеробифункциональный реагент, лактон n-изотиоцианатобензоил-D,L-гомосерина [40, 101]. Сначала аминогруппы пептида реагируют с группами N=C=S реагента. Обработка полученного соединения ТФУ ведет к образованию лактона и укороченного на одну аминокислоту пептида со свободной N-концевой аминогруппой. Затем пептид конденсируют с носителем, содержащим аминогруппу; при этом лактон, оставшийся присоединенным к боковой цепи остатка Lys, реагирует с аминогруппами носителя. Активация пептида в виде соединения, имеющего лактонный фрагмент, оказалась высокоэффективным средством увеличения выхода на стадии присоединения пептида [45]. Не требуется большого избытка реагента, обычно применяемого для предотвращения поперечного сшивания пептида, так как две группы реагента сильно различаются по реакционной способности.

Пептиды можно присоединить к носителю в два приема — сначала высокоэффективным, хорошо отработанным методом «пришить» его к носителю временной связью, потом жестко присоединить требуемой связью за счет внутримолекулярной реакции. Например, пептиды, не содержащие Lys, присоединяли к носителю сначала за а-аминогруппу при помощи ДИТЦ, затем за карбоксильную группу посредством обычно менее эффективной карбодиимидной конденсации [90]. Предварительное временное присоединение сильно повысило эффективную концентрацию пептида на поверхности носителя, что увеличило выход второго присоединения. Последующая обработка ТФУ вызывает отщепление N-концевой аминокислоты; полученный укороченный пептид готов к определению последовательности. Истинно внутримолекулярный механизм присоединения был использован в работе [105], где применялся предложенный ранее метод четырехкомпонентной конденсации [104]. Оба упомянутых подхода по глубине замысла являются наиболее развитыми и обладают многообещающим потенциалом.

Во внутримолекулярном «содействии» реакции присоединения могут участвовать и нуклеофильные группы носителя. Этим может объясняться повышенная реакционная способность 1,2-диаминов по сравнению с моноаминами [45]. Например, матрицы, несущие этилендиамин или триэтилентетрамин (ТЕТА), являются по отношению к лактону гомосерина более реакционноспособными, чем w-алкиламины. Поэтому при выборе метода конденсации пептида следует учитывать характер нуклеофильных групп носителей, подбирая их таким образом, чтобы при использовании данного метода активации карбоксильных групп присоединение прошло эффективно.

Избыток неиспользованных аминогрупп носителя может вызвать осложнения. Если после присоединения пептида эти группы остаются немодифицированными, то они будут карбамоилированы на первой же стадии реакции Эдмана. По нашим данным, это приводит к ухудшению результатов отщепления и высокому уровню фона [64]. При использовании МИТЦ вместо ФИТЦ на первом цикле отщепления значительно увеличивается выход отщепленных аминокислот и снижается уровень фона. Для успешного определения последовательности на микроуровне очень важно найти еще более эффективный реагент для «забивки» остаточных аминогрупп носителя. При этом реагент не должен необратимо блокировать аминогруппу N-концевой аминокислоты или изменять строение боковых цепей аминокислот. Если N-концевая аминогруппа пептида предварительно защищена БОК или другой легкоудаляемой группой, то эффективным методом «забивки» может быть ацетилирование избытка реакционноспособных аминогрупп носителя мягкими реагентами — сложными эфирами уксусной кислоты. После присоединения БОК пептидов к макропористым полистирольным смолам мы обрабатываем носитель метилацетимидатом (G. С. DuBois, V. Alvarez, E. Apella, неопубликованные данные). Положительно заряженные амидиновые группы, появляющиеся на смоле после «забивки», возможно, увеличивают гидрофильность и сольватацию носителя. В целом операция «забивки» позволяет улучшить структуру поверхности носителя.

Однако планируя и проводя такую обработку поверхности, надо предусматривать и исключать возможность последующих побочных реакций между функциональными группами модифицирующего агента и присоединенным пептидом, которые приводят к падению выходов при определении последовательности я возрастанию уровня фона.