Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Новейшие методы твердофазного и жидкофазного определения аминокислотной последовательности
Твердофазный анализ. Новейшие подходы
Отщепление по Эдману

Предварительное расщепление пептидов, присоединенных к ТФ-носителям, проводится почти исключительно по методу Эдмана с применением реагентов и условий, аналогичных таковым для ЖФ-анализа. Обсуждение этих методик читатель может найти в литературе, относящейся к разд. 16.2.1.

Главное преимущество химии ТФ-анализа заключается в гибкости выбора буферов, растворителей, режимов промывок, реагентов, различных добавок, температуры. Потери образца с экстракциями, а также летучесть или растворимость вещества в ходе анализа налагают очень незначительные ограничения па рабочие параметры, за исключением тех случаев, когда пептиды присоединены адсорбционными связями или когда реакции проводят в газотвердофазной системе.

При работе и ЖФ- и ТФ-методами следует предъявлять одинаково высокие требования к чистоте используемых реактивов и растворителей. Нельзя полностью исключить присутствие вредных примесей и протекания побочных реакций, но их влияние значительно снижается при использовании минимальных объемов и концентраций реагентов. ТФ-реакции можно проводить в постоянном потоке свежих реагентов с удалением побочных продуктов; это преимущество легко реализовать в миниатюризованных системах, где перенос тепла (при предварительном подогреве реагентов) не представляет проблемы.

16.2.4.1. Реакции присоединения реагента. В этой реакции образования фенилтиокарбамоилпептидов (ФТК-пептидов) или их аналогов буферы не играют никакой роли в образовании пленки и удержании пептида; в ходе реакции высвобождается или потребляется очень мало водородных ионов, и поэтому ее можно проводить, используя очень низкие концентрации буфера. Представляется заманчивым увеличить эффективность взаимодействия реагента с полипептидом путем использования различных добавок (денатурирующие вещества, катализаторы реакции, поглотители примесей), однако при введении этих новшеств следует взвешивать возможность появления побочных процессов. Поглотители (например, первичные амины), используемые в молярных концентрациях, превышающих концентрации пептидов (но не изотиоцианата), могут быть полезны в анализе и на микроуровне, так как с их помощью можно удалить альдегиды и другие высокоактивные примеси. Верхний предел концентрации аминов определяется еще и тем, что их присутствие не должно вызывать побочных реакций, подобных тем, что происходят после «забивки» ФТК-группами поверхности носителя.

Правильный выбор реагента для реакции — принципиальное условие успеха. Выбор водных сред вместо неводных частично вызван необходимостью сольватации присоединенных пептидов, имеющих разный состав. Вода облегчает сольватацию, но она же вызывает гидролиз изотиоциапата, приводящий к последующим побочным реакциям. При решении этого вопроса следует непредубежденно относиться к новым предложениям.

16.2.4.2. Реакции отщепления. ТФУ оказалась наилучшим из отщепляющих агентов, найденных до сих пор. Ее легче очищать, чем более высокомолекулярные перфторокислоты, а ее летучесть оказывается преимуществом при получении и превращениях отщепленных продуктов (анилинотиазолинонов, АТЗ).

В принципе можно использовать и другие сильные кислоты, например BF₃. Решающим доводом «за» или «против» использования того или иного метода отщепления может служить выход Ser в виде ФТГ или другого производного, пригодного для идентификации.

В ТФ-методе тиазолинон аминокислоты (АТЗ) обычно смывают с колонки той же кислотой, которой проводят отщепление АТЗ. Поскольку ТФУ — сильный элюирующий растворитель, то на этой стадии цикла она смывает со смолы многие адсорбированные вещества, которые оказываются в растворе вместе с АТЗ и загрязняют его.

При малых размерах реакционной колонки собранные АТЗ нетрудно охладить сразу после их образования и тем самым предохранить от разрушения. Отщепление обычно проводят при повышенных температурах в течение времени, достаточного для получения наиболее трудно отщепляемых остатков (например, Pro [15, 41]). В другом варианте можно проводить циклизацию и отщепление парами кислоты, действующими на сухой связанный пептид [42, 56]. После вытеснения паров кислоты инертным газом АТЗ можно смыть растворителем с меньшей элюирующей способностью, чем ТФУ, и поэтому в растворе будет меньше загрязняющих примесей.

Отщепление АТЗ кислотой следует заканчивать до начала их элюирования с колонки (или проводить отщепление в несколько приемов с промежуточными высушиваниями колонки). При этом высокореакционноспособные АТЗ концентрируются на поверхности носителя при повышенной температуре. Так как при выдерживании в этих условиях они склонны к разрушению, то при выборе режима отщепления АТЗ следует опираться на тщательный контроль условий эксперимента.

Необходимо контролировать содержание воды в ТФУ. Если кислота содержит слишком мало воды, то она находится в равновесии с небольшим количеством трифтороуксусного ангидрида. Последний может реагировать с ФТК-пептидом, давая нерастворимый побочный продукт [8]. Ангидрид может удерживаться адсорбционными силами на поверхности носителя при помощи потенциально реакционноспособных трифтороацетильных производных различных структурных элементов носителя (например, ОН- и NH-гpyпп [91]). Эти производные при добавлении буфера (на стадии присоединения реагента в следующем цикле) блокируют N-копцевую аминокислоту пептида.

В то же время слишком высокое содержание воды в ТФУ приводит к недопустимо высокому уровню расщепления внутренних пептидных связей и снижает скорость отщепления АТЗ. До сих пор неясно, какое содержание воды следует считать разумным компромиссом. Необходима разработка удобных и надежных методов определения содержания воды в ТФУ.

16.2.4.3. Реакции превращения. Аминокислоты, отщепленные ТФ-методом в виде АТЗ, обычно превращают в ФТГ-производные аминокислот теми же способами, что и в ЖФ-анализе. Некоторые из последних результатов в обнаружении и количественном определении ФТГ-производных аминокислот приведены в разд. 16.3.3. Недавно была предложена новая реакция превращения, использованная и в ТФ, и в ручном варианте определения — быстрый аминолиз тиазолинонов (в сухом состоянии или в растворе) первичными алкиламинами, дающими алкиламиды ФТК-аминокислот [1, 50, 51, 57]. Эти реакции не требуют нагревания или экстракции. По окончании реакции избыток амина удаляется в потоке азота. По-своему хроматографическому поведению и поглощению в УФ-области спектра алкиламиды подобны ФТГ-аминокислотам. Детали методики изложены в работе [51]. Несколько интересных реакций конверсии кратко описаны в сообщении [81]. 5-Метилтиазолиноны (МТА) можно О-ацетилировать уксусным ангидридом и затем идентифицировать полученные производные методом ГЖХ. МТА можно расщепить водным аммиаком и получить амиды исходных аминокислот.

16.2.4.4. Идентификация и количественный анализ. Чувствительность процесса определения последовательности можно увеличить, используя на стадии присоединения модифицированные реагенты. В данной главе не рассматриваются методы, связанные с использованием радиоактивных меток или интенсивно окрашенных изотиоцианатов, так как они с самого начала развивались в рамках методологии ручного или автоматизированного ЖФ-определения последовательности.

Описано использование [³⁵S]ФИТЦ в автоматическом ТФ-анализе [17, 18]. Хотя в лучших экспериментах провозглашалась возможность обнаружения пикомольных количеств ФТГ-аминокислот, в повседневной практике определение проводили на уровне ≥100 пмоль (Waxdall, частное сообщение). Главными проблемами являются, во-первых, относительно низкий уровень удельной радиоактивности доступного реагента, во-вторых, разбавление реагента в больших полостях реактора и системы подачи реагента в реактор.

Предложена усовершенствованная схема подачи [³⁵S]ФИТЦ, [44]. Для резкого уменьшения объема колонки необходимо существенное улучшение свойств ТФ-носителей. Указанные нововведения должны также снизить уровень радиоактивного фона, который становится серьезной проблемой при работе с пикомольными количествами пептида. Мы полагаем, что в будущем возможности анализа чрезвычайно малых количеств вещества с применением радиоактивных изотиоцианатов окажутся гораздо более благоприятными для ТФ-метода, чем для ЖФ-определений. Чувствительность ТФ-анализа можно существенно увеличить и без применения дорогостоящих и опасных радиоактивно меченных реагентов. Описан ручной ТФ-метод с применением 1N,N-ди метил аминоазобензол-4'-изотиоцианата

(ДАБИТЦ) [21] (гл. 14). Этот реагент дает интенсивно окрашенные тиогидантоиновые производные (ДАБТГ). Недавно эти производные были разделены, идентифицированы количественно при помощи ВЭЖХ на уровне 5—10 пмоль [24, 107]; ДАБТГ-производные аминокислот поглощают при длине волны 436 нм. Сообщалось об использовании этого метода в автоматическом ТФ-анализе [46]. В каждом цикле после реакции взаимодействия ДАБИТЦ с полипептидом для полной «забивки» N-концевых аминогрупп проводят дополнительную реакцию с более эффективно реагирующими ФИТЦ. Получающиеся ФТГ-аминокислоты бесцветны и не мешают идентификации окрашенных тиогидантоинов [23]. По нашему мнению, проведение реакции в колонке (ручным методом или автоматическим) дает значительные преимущества по сравнению с исходным вариантом метода (реакция в пробирке) [21]. Мы успешно проводили ручное ТФ-определение последовательности (при помощи ФИТЦ) на малых количествах пептидил-носителя, помещенного поверх крошечного кусочка стеклянной ваты в суженной части пастеровской пипетки. Последнюю укоротили с обоих концов; получившуюся маленькую колонку обогревали внутри пробирки, помещенной в баню с пропиленгликолем; промывку колонки легче проводить, приложив небольшое избыточное давление азота.