Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Новейшие методы твердофазного и жидкофазного определения аминокислотной последовательности
Твердофазный анализ. Новейшие подходы
Другие методы последовательного отщепления

Твердофазный метод позволяет использовать для анализа аминокислотной последовательности подходы, отличающиеся от реакции Эдмана. Многие реагенты, пригодные для проведения альтернативных химических реакций, нельзя применять в ЖФ- методе из-за того, что простой экстракцией часто невозможно полностью удалить избыток реагентов и продукты побочных реакций.

Ниже изложены основы нескольких альтернативных подходов, рассматриваются их возможности и ограничения.

16.2.5.1. Определение N-концевой последовательности при помощи тиоацилирования и кислотного отщепления. Несколько методов последовательного отщепления основаны на присоединении тиоацильной группы R = C = S к N-концевой аминогруппе пептида с последующей циклизацией N-концевого остатка в кислых условиях и отщеплением его в виде тиазолинона [4, 75, 84]. Этот подход отличается от метода Эдмана и реагентом, используемым па стадии конденсации, и механизмом реакции. Кроме того, на стадии отщепления производного аминокислоты вместо 2-анилинотиазолинона образуется 2-алкил- или 2-арилтиазолинон. Образование этих производных имеет несколько дополнительных преимуществ. Более слабый электронооттягивающий характер алкильной или арильной групп делает тиокарбонильный атом серы более нуклеофильным. Поэтому циклизация (и отщепление) происходит в менее жестких условиях. Отщепление пои помощи ТФУ завершается при комнатной температуре в течение 20 мин [4, 84]. При повышении температуры реакции можно использовать более слабые кислоты или разбавленную ТФУ. Таким образом, возможно, удастся снизить остроту многих проблем, возникающих на стадии кислотного отщепления в реакции Эдмана: расщепление пептидной цепи, дегидратация Ser, Thr, образование сукцинимида из остатка Asn, окисление Тrр, циклизации N-концевого Gin в пироглутаминовую кислоту. Следует отметить, что указанные тиазолиноны более устойчивы, чем соответствующие промежуточные продукты реакций Эдмана, и они не могут изомеризоваться в тиогидантоины. Это важное обстоятельство должно способствовать значительному увеличению выходов в альтернативных реакциях превращения, дающих продукты, подлежащие идентификации.

Таблица 16.1. Тиоацилирующие реагенты (общая формула RC(:S)—X), используемые для последовательного расщепления пептидов

Для успешного применения этого подхода к анализу последовательности аминокислот необходимо найти такие тиоацилирующие агенты и условия проведения процесса, которые по своей эффективности на стадии конденсации с пептидом не уступали бы ФИТЦ. Использовались реагенты общего вида RC(:S)—X, где R — алкильный или арильный (ароматический компонент), X — активирующая уходящая группа, например —SR', —QR', —N<R'. Тиоацилхлориды (Х = Сl) обладают высокой реакционной способностью, но они слишком неустойчивы. Тиоацилирующая способность увеличивается по мере увеличения электронооттягивающей силы ацильного заместителя R. Но эта тенденция сопровождается снижением скорости реакции циклизации, так что при выборе подходящего реагента для конденсации с пептидом должен соблюдаться компромисс, помогающий эффективно проводить обе стадии цикла. Опробовано большое число соединений; наиболее перспективные реагенты для последовательного отщепления аминокислот указаны в табл. 16.1. Наличие зарядов на уходящих группах (соединения 1, 6 и 7) чрезвычайно облегчает растворимость реагентов в водноорганических средах, хотя в анализе можно без осложнений использовать системы из безводных растворителей и незаряженных реагентов.

Реакционная способность простых алкилкарбодитионатов (соединения 8—12) очень мала, что делает их практически непригодными для использования, за исключением реакций, проводимых в присутствии катализаторов общего основного типа (например, ацетата триэтиламмония) в сильнополярных растворителях [83]. Катализ в реакции тиоацилирования может быть внутримолекулярным, как в случае аминолиза холинового эфира м-нитробензойной кислоты [7] (табл. 16.1, соединение 6). Этот реагент необыкновенно устойчив к гидролизу. Цианометиловые дитиоэфиры (например, соединение 2) достаточно реакционноспособны [84], но уходящая отщепляемая группа полимеризуется, что приводит к образованию осадков, от которых трудно избавиться. Недавно был описан легко синтезируемый реагент (соединение 5) [19].

Известен вариант автоматического ТФ-анализа, основанный на реакции тиоацилирования [29, 70, 75]. В ходе определения структуры В-цепи инсулина при помощи тиоацетилтиогликолевой кислоты (соединение 7) были успешно идентифицированы 26 аминокислотных остатков; для нескольких белков удалось определить последовательность протяженностью до 40 аминокислот. Постадийные выходы составляли >95%. Идентификацию отщепленных остатков проводили после превращения АТЗ в тиоациламииокислоты или после обратного гидролиза в исходные аминокислоты. Известен вариант быстрой конверсии 2-фенилтиазолинона в метиламид тиобензоиламинокислоты избытком метиламина. Это «мягкое» превращение в будущем может играть важную роль в отщеплениях, проводимых с участием тиоацилирующих реагентов. 2-Фенилтиазолиноны идентифицированы масс-спектрометрически [5]. Эти соединения также превращали в анилиды тиобензоиламинокислот и идентифицировали методом ТСХ [6], однако такой вариант аминолиза проходит медленнее, чем аналогичная реакция с метиламином.

16.2.5.2. С-концевое отщепление. Предложен ряд методов последовательного химического расщепления по карбоксильному концу молекулы пептида (гл. 18). Первые попытки в этом направлении были предприняты еще до описания реакции Эдмана, но они не смогли составить конкуренцию последней. В перспективном, тщательно изученном методе [98] С-концевой карбоксил пептида реагирует с тиоцианатом аммония в уксусном ангидриде: полученный при этом циклический пептидилтиогидантоин обрабатывается кислотой (или ацетогидроксаматом); продуктами последней реакции являются тиогидаптоин С-концевого остатка и пептид, укороченный на одну С-концевую аминокислоту. В исходной методике каждый цикл отщепления включал длительные и трудоемкие стадии разделения и сушки. Удавалось отщепить только 2—6 остатков. Однако в связи с развитием ТФ-метода с этим подходом связаны новые надежды [26, 27, 58]. В цитированных работах сделан общий обзор методов С-концевого анализа.

ТФ-подход значительно стимулировал развитие работ по тиоцианатному расщеплению, хотя до сих пор не удавалось отщепить более 6 аминокислот. Особые сложности возникают при анализе как самих остатков Asn, Asp, Glu, Pro, так и остатков, следующих за ними. Pro отщепляется на первой же операции «своего» цикла отщепления (обработка тиоцианатом аммония), поэтому вместе с ним в продуктах того же цикла появляется следующая аминокислота [58]. Отщепление других вышеприведенных аминокислот происходит с низкими выходами. Идентификацию тиогидантоинов проводили различными методами без использования преимуществ высокочувствительной фотометрии. Трудно оценить возможность определения длинных участков последовательности без проведения дополнительной вдумчивой и систематической работы. Мы надеемся, что подобное исследование будет продолжено, так как С-концевые отщепления могут очень полезно дополнять анализ N-концевой последовательности. Кроме того, количественное присоединение пептидов по а-аминогруппе к нерастворимому носителю происходит в целом значительно легче, чем конденсация по С-концевому карбоксилу.

Предлагались иные подходы к определению С-концевой последовательности в комбинации с ТФ-методом. Пептид присоединяли с помощью карбодиимида к S-алкилтиурониевой соли, затем отщепляли С-концевой остаток в виде иминогидантоина водным раствором основания при pH 10—11,5. Таким путем определяли до пяти С-концевых аминокислот коротких пептидов. Преимущество этого метода перед тиоцианатным заключается в том, что он проводится в более мягких условиях, а недостатком является невозможность отщепления С-концевого Pro; при наличии в этом же положении Asp или Glu последние склонны к образованию циклических ангидридов при конденсации с участием карбодиимида [99].

Недавно сообщалось о новых возможностях проведения С-концевого анализа на нерастворимых носителях. Показано, что сложноэфирную связь можно циклизовать в С-концевой алкоксазол при помощи сильных дегидратирующих агентов [83]. Последующая обработка спиртом в кислой среде дает сложный эфир аминокислоты. Существует другая, отличная от этого подхода схема анализа последовательности с использованием нескольких новых синтетических реагентов [68]. Оба этих подхода, существующие пока только в виде лабораторных разработок; они интересны для творчески мыслящего химика тем, что открывают новые пути к большой цели.