Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидов химическими методами
Частичный кислотный гидролиз
N-О-ацильная миграция

Пептидные связи с участием аминогрупп серина и треонина также довольно легко гидролизуются в кислой среде при комнатной температуре; в особенности чувствительны к гидролизу серинсодержащие пептиды [95]. По-видимому, механизм гидролиза включает миграцию ацильной группы и последующий гидролиз сложноэфирной связи [уравнение (2.11)]. N→O-ацильная миграция идет в концентрированных безводных кислотах, таких, как серная, фосфорная, фтороводородная или муравьиная. Классическим реагентом, практически исключающим неспецифический гидролиз, является концентрированная серная кислота [40, 42]. Показано, например, что инсулин после обработки серной кислотой сохраняет биологическую активность [62]. Однако при этом может идти частичное сульфирование тирозина и частичное разрушение триптофана.

При фрагментации по остаткам серина и треонина с помощью реакции N→О-ацильной миграции особого внимания заслуживает избирательный гидролиз сложноэфирной связи («О-пептидной» связи) по серину и треонину. В принципе гидролиз сложноэфирной связи можно проводить как в кислой, так и в основной среде. Поскольку, однако, в основной среде гидролиз приводит к образованию исходного ациламида, необходимо предварительно защитить аминогруппы путем ацилирования. Наличие защиты позволит исключить обратную реакцию O→N-ацильной миграции и тем самым обеспечить высокий выход продуктов реакции. Обратимость реакции миграции в основной среде объясняется образованием циклического гидроксиоксазолидина [95].

N-ацилирование проводят в присутствии большого избытка уксусного или муравьиного ангидрида. Для последующего секвенирования пептидных фрагментов необходимо провести гидролиз ацильных групп. Формильную защиту снимают кратковременной обработкой НСl в метаноле при комнатной температуре, более устойчивые ацетильные группы отщепляют 0,01 М КОН. Из других методов расщепления «О-пептидных» связей следует упомянуть реакцию с гидроксиламином или гидразином с образованием гидроксамовых кислот или гидразидов N-концевых партнеров гидроксиаминокислот (серина и треонина); для этих целей применяли также 1М пиперидин [64]. Относительно определения ацетильных и формильных групп см. разд. 8.13.

Гидролиз сложноэфирных связей проводят также в 6М НСl; однако, поскольку с увеличением времени гидролиза возрастает вероятность неспецифического расщепления пептидных связей, необходимо предельно ограничить время реакции.