Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Рентгеновская кристаллография и электронная микроскопия
Электронная микроскопия
Подготовка образцов и их «окрашивание»

Для электронного микроскопирования биологические объекты обычно заключают в подходящий полимерный носитель и затем разрезают на тонкие слои с помощью стеклянного или алмазного ножа. При изучении макромолекул исследователь имеет дело с их раствором в подходящем буфере. Два фактора определяют выбор такого буфера: во-первых, летучесть в процессе высушивания и, во-вторых, инертность к «красителю». В практике чаще всего используют буфер, приготовленный на основе ацетата аммония. И хотя такой буфер летуч, не следует забывать, что в процессе высушивания образца он многократно концентрируется. Иногда такое концентрирование буфера приводит к изменению структуры или, например, агрегации молекул так, что их микроскопирование после «окрашивания» выявляет наличие искажений или разрушения исследуемого объекта.

В микроскопе образец помещают на тонкую (~15 нм) углеродную пленку. Такую пленку можно получить путем конденсации паров углерода на поверхности свежего скола слюды. Для изготовления пленки используют углеродные стержни диаметром 5 мм. Конец одного из стержней длиной 10 мм стачивают до диаметра 1,5 мм и заостряют. Заточенный кончик такого стержня приводят в контакт с плоским торцом второго стержня и испаряют, пропуская через область контакта электрический ток силой ~30 А. Испарение происходит в самой тонкой части стержня, а постоянство контакта осуществляют поджатием одного из стержней с помощью пружины (рис. 20.14).

РИС. 20.14. Испаряемый в вакууме углерод конденсируется на поверхности слюды, и образовавшуюся пленку можно снять на поверхность воды.

Испаряемый углерод конденсируется на поверхности слюды, расположенной на расстоянии ~200 мм от источника испарения. Если поместить за слюдой листок белой бумаги, она также покроется слоем углерода с тенью от кусочка слюды. При наличии некоторых навыков контрастность «затененного» участка можно использовать в качестве удобного визуального критерия толщины углеродного слоя.

Углеродную пленку можно легко удалить с поверхности слюды, поскольку она чрезвычайно гидрофильна. Это делается медленным погружением слюды в чистую воду под углом ~45° относительно поверхности воды. Угольная пленка отделяется от слюды и всплывает на поверхность воды, где ее можно перемещать, например, с помощью тонкого волоска. Очень важно на всех этапах приготовления таких пленок соблюдать чистоту. Так, подрезание краев пластинки слюды надо выполнять тонкими ножницами, а расщеплять и держать ее следует только пинцетом. Чашка Петри для воды должна быть вымыта с применением детергента, который надо тщательно отмыть. После прокаливания в пламени ее заполняют водой, перегнанной в стеклянном дистилляторе. Такие предосторожности позволяют избежать загрязнений поверхности слюды и воды, которые могут мешать снятию пленки.

Такие тонкие пленки монтируют на мелкоячеистые (200 или 400 меш) медные сеточки диаметром 3 мм. Целесообразно поместить сразу несколько их десятков на подставку или проволочную сетку, расположенную ниже поверхности воды, еще до того, как снимать угольную пленку со слюды. В этом случае для того, чтобы смонтировать пленку, достаточно после ее снятия со слюды просто поднять подставку или понизить уровень воды. При аккуратном выполнении описанных выше процедур большая часть сеточек оказывается покрытой угольной пленкой по всей поверхности. Следует помнить, что сеточки и подставка должны быть предварительно обезжирены органическим растворителем или прокаливанием. Смонтированную угольную пленку высушивают на воздухе и хранят в эксикаторе.

20.2.5.1. «Окрашивание» образцов. Существуют два типа «окрашивания» — позитивное и негативное. При позитивном «окрашивании» молекулы «красителя» (соли тяжелых металлов) присоединяются к тем или иным группировкам макромолекулы [12]. В случае негативного «окрашивания», чаще называемого негативным контрастированием, макромолекулы заключаются в тонкую пленку контрастирующего вещества. На рис. 20.13 показано, как при этом образуются области, недоступные для контрастирующего вещества и, следовательно, обладающие меньшей электронной плотностью [6, 8].

При позитивном проявлении образец вначале окрашивают в растворе, а затем помещают на сеточку. При негативном контрастировании каплю раствора, содержащего исследуемый объект, помещают на сеточку, покрытую углеродной пленкой. Обычно одной минуты достаточно, чтобы молекулы или частицы исследуемого образца адсорбировались на пленке. Затем жидкость удаляют, прикасаясь ребром сеточки к фильтровальной бумаге. Не дожидаясь полного высыхания, па сеточку наносят каплю раствора «красителя». Через ~15 с раствор контрастирующего вещества по возможности полностью удаляют фильтровальной бумагой и сеточку сушат на воздухе.

Важно, чтобы угольная пленка была смачиваемой. Это обычно бывает заметно после удаления избытка жидкости с ее поверхности. Смачиваемость пленки меняется в зависимости от атмосферных условий, продолжительности и условий ее хранения. Существуют различные способы улучшения смачиваемости, если по каким-либо причинам образец или «краситель» не растекаются по ее поверхности. Простейший из них состоит в увеличении времени, в течение которого образец находится на сеточке. Можно также просто перед использованием подержать сеточки с пленкой в увлажненной чашке Петри несколько часов. И наконец, можно подвергнуть пленку ультрафиолетовому облучению или ионной бомбардировке. Правда, в этих случаях пленка может стать слишком гидрофильной, так что капли будут растекаться по обеим поверхностям.

20.2.5.2. Оттенение. Другой метод увеличения контрастности изображений состоит в покрытии поверхности образца тонким слоем атомов тяжелого металла, испаряемого при высокой температуре. Источник испаряемого металла располагают под некоторым углом относительно образца, так чтобы поток испаряемых атомов конденсировался в соответствии с рельефом па поверхности. Контрастность обеспечивается тем, что испаряемый металл конденсируется преимущественно па выступающих частях поверхности образца. Из изображений, полученных с помощью такого метода, можно извлечь количественную информацию о распределении контрастирующего вещества по контурам структур [13]. Некоторые проблемы, возникающие при таком способе контрастирования образца можно обойти, если вращать его во-время оттенения.

Разрешение на оттененных образцах невелико. Процесс оттенения происходит обычно успешно, если образец имеет неровную поверхность и вся содержащаяся в нем вода удалена. Однако разрушения нативной структуры могут быть значительными, хотя основные ее особенности и сохраняются.