Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидов химическими методами
Расщепление по остатку тирозина
Цианирование с помощью 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты

Образец белка растворяют в 0,2 М трис-ацетатном буфере (pH 8), содержащем 6 М гуанидин-HCl. Если белок не содержит S—S-групп, в буфер добавляют небольшой избыток дитиотреита и инкубируют при 20 °С в течение 30 мин. С целью восстановления S—S-групп создают 10 мМ концентрацию дитиотреита и инкубируют при 37 °С в течение 1—2 ч. Затем прибавляют 2-нитро-5-тиоцианобензойную кислоту (5-кратный молярный избыток в расчете на SH-группу), в случае необходимости pH поддерживают с помощью NaOH и инкубируют при 37°С в течение 15 мин. Подкисляют реакционную смесь до рН≤4, охлаждают до 4°С и отделяют низкомолекулярные компоненты диализом или гель-фильтрацией в 50%-ной уксусной кислоте или в другом летучем буфере с низким pH. Образец можно хранить в 50%-ной уксусной кислоте при —20°С. Для проведения реакции расщепления образец тщательно высушивают, вновь растворяют в 0,1 М Na-боратном буфере (pH 9,0), содержащем 6М гуанидин-HCl, и инкубируют при 37°С в течение 12—16 ч.

Широкому применению метода расщепления по цистеину с целью получения крупных фрагментов препятствует то обстоятельство, что С-концевой фрагмент блокирован по аминогруппе остатком иминотиазолидина. Попытки деблокирования с помощью классического секвенирования по Эдману дали отрицательный результат [96]. Таким образом, полученные пептиды, за исключением N-концевого, не могут быть использованы для прямого секвенирования. Недавно предложен метод модификации указанных пептидов на никеле Ренея [133]. После обработки защищенных пептидов активным (нейтральным) катализатором W-6 в нейтральной среде при 50 °С в течение 6—10 ч происходит мягкое десульфирование с образованием N-аланилпептидов с выходом 90% [9]. В ходе реакции цистеин и метионин с высокой скоростью превращаются в аланин и a-а миномасляную кислоту соответственно.

2.7.1.1. Методика [133]. Десульфирование проводят в 0,05М трис-НСl-буфере (pH 7) при 50°С. Готовят никель Ренея W-6 [9]. Смесь 20 мг пептида и 200 мг катализатора в 50 мл буферного раствора нагревают до кипения в течение 7 ч в атмосфере азота. Жидкость над осадком фильтруют через колонку (0,6x5 см) с комплексообразующей смолой Chelex-100. Пептиды элюируют 1 М аммиаком, элюат высушивают лиофильно. Благодаря высокому выходу в реакциях расщепления и последующего десульфирования иминотиазолидинпептидов эта методика вполне может использоваться в химии белка с целью получения крупных фрагментов.