Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Методы модификации белков
Модификация остатков лизина

Описано несколько методов модификации лизина, наибольший интерес из которых представляют цитраконилирование, малеилирование и трифтороацетилирование. Выбор метода зависит от относительной стабильности модифицированных групп при последующей обработке препаратов белка. Все три варианта модифицированного лизина устойчивы в диапазоне pH 8—9. Однако цитраконильные и малеильные производные неустойчивы в кислотных условиях, а трифтороацетильные — при высоких pH. Кроме указанных типов модификации следует упомянуть тетрафторосукцинилирование, которое приводит к получению производных лизина, неустойчивых в щелочной среде [8J. В связи с этим метод не нашел практического применения. Результаты изучения стабильности модифицированного лизина, степени регенерации аминогрупп и реконструкции нативной структуры и биологической активности исследуемых белков приведены в работе [2]. Из всех известных способов модификации остатков лизина наиболее предпочтительно цитраконилирование, поскольку в этом случае деблокирование проходит в мягких условиях и с высоким выходом при сохранении биологической активности исследуемого белка. К недостаткам метода относится высокая лабильность цитраконильных групп при 40 °С даже при pH 8,0. Если по условиям эксперимента белок необходимо выдерживать в указанных условиях в течение длительного времени, то более целесообразно использовать малеилирование. Еще одним недостатком обоих методов является возможность алкилирования свободных сульфгидрильных групп [9]. Если после деблокирования остатков лизина необходимо регенерировать сульфгидрильные группы, их предварительно переводят в S-сульфопроизводные, либо в смешанные дисульфиды (например, с цистеином).

3.4.3.1. Цитраконилирование. Для обратимой модификации остатков лизина в качестве реагента используют цитраконовый ангидрид [14]. Реакцию проводят при перемешивании и 20 °С, pH реакционной среды контролируют с помощью рН-метра. Белок (15 мг/мл) растворяют или суспендируют в воде и доводят pH до 8,0. К раствору небольшими порциями (1 мкл/мг белка) добавляют цитраконовый ангидрид и поддерживают pH 8,0 подтитровывая реакционную смесь 5 М NaOH. Через 30 мин pH реакционной среды не меняется, что свидетельствует о завершении реакции. Модифицированный белок подвергают диализу или гель-фильтрации в 0,1 М бикарбонате аммония. Большинство белков в результате модификации переходит в раствор. Однако в случае необходимости реакцию можно проводить в растворе мочевины или гуанидин-НСl.

Цитраконильные группы гидролизуют путем инкубирования при pH 3,5 и 20 °С в течение 12 ч. Скорость реакции деблокирования возрастает с уменьшением pH. Так, например, было предложено использовать для гидролиза диализ против 10 мм НСl (pH 2,0) при 20 °С в течение 6 ч [30].

3.4.3.2. Малеилирование. На основании изучения условий малеилирования [9] было предложено проводить реакцию в карбонатном или фосфатном буферных растворах при 2 °С. Деблокирование проводят в более жестких условиях по сравнению с цитраконилированными белками. Период полупревращения защитных групп в реакции деблокирования при pH 3,5 и 37 °С составляет 11 —12 ч. Деблокирование проводят обычно при pH 2,5 и 40 °С в течение 120 ч [24].

Методика [10]. Перед употреблением малеиновый ангидрид очищают возгонкой. 20 мг бычьего химотрипсиногена растворяют в 20 мл 0,1 М пирофосфатного буфера (pH 9,0), затем при 2 °С добавляют 300 мкл (6 порций по 50 мкл) 1,0 М раствора малеинового ангидрида в перегнанном диоксане. pH 9,0 поддерживают титрованием 0,1 М NaOH. Обессоливание проводят путем гель-фильтрации на колонке (3X40 см) с сефадексом G-25 в 0,01 М растворе аммиака. Для снятия малеильных групп раствор белка титруют муравьиной кислотой и аммиаком до pH 3,5 и раствор инкубируют при 37 °С в течение 30 ч, а затем при 60 °С в течение 60 ч.

Методика частичного малеилирования описана в разд. 4.4.6.2.

3.4.3.3. Трифтороацетилирование. Трифтороацетильную группу вводят с помощью S-этилтиолтрифтороацетата [33, 37]. Белок растворяют в воде или растворе мочевины и титруют до pH 10 1 М КОН. Раствор тщательно перемешивают, добавляют

S-этилтиолтрифтороацетат, (10 мкл/мг белка) и инкубируют при 20 °С, поддерживая pH с помощью 1 М КОН. Избыток реагента удаляют диализом.

Трифтороацетильные защитные группы гидролизуют в присутствии 1 М пиперидина при 0°С в течение 2 ч. Затем pH доводят до 6 с помощью 0,5 М уксусной кислоты и избыток реагента удаляют путем лиофильного высушивания.