Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Методы модификации белков
Алкилирование сульфгидрильных групп

Известно несколько алкилирующих реагентов, и выбор реагента зависит от свойств функциональной группы, которую необходимо ввести в полипептидную цепь. Далее обсуждаются три наиболее распространенных способа алкилирования.

3.4.2.1. Карбоксиметилирование. Карбоксиметилирование — наиболее общепринятый метод модификации сульфгидрильных групп белков. Для введения кислотных или нейтральных группировок в качестве реагентов используют иодоуксусную кислоту или иодоацетамид. Предварительно оба реактива перекристаллизовывают для удаления свободного иода. Иодоуксусную кислоту перекристаллизовывают из гексана, иодоацетамид — из петролейного эфира. Оба реагента добавляют в реакционную смесь в небольшом избытке относительно общей концентрации сульфгидрильных групп. Раствор иодоуксусной кислоты перед использованием нейтрализуют с помощью триса или NaOH. Реакцию проводят при 0 °С в течение 1 ч. В этих условиях исключается возможность алкилирования других функциональных групп белка. Метод подробно обсуждается в работе [37] и в разд. 2.2.1.

Оба реактива доступны в виде радиоактивно меченных препаратов и могут использоваться для введения в полипептидную цепь радиоактивной метки. При введении метки вначале добавляют радиоактивный препарат (иодоуксусную кислоту или иодоацетамид), а затем небольшой избыток «холодного» реагента. При этом достигается наиболее высокая степень включения метки, так как известно, что реакционная способность сульфгидрильных групп значительно выше по сравнению с восстановителем, присутствующим в реакционной смеси.

3.4.2.2. Аминоэтилировоние. S-Аминоэтильную группу вводят в полипептидную цепь с помощью алкилирования сульфгидрильных групп этиленимином [81, 82]. Этот тип модификации имеет большое значение, так как аминоэтилцистеин — аналог лизина, чувствительный к действию трипсина (разд. 3.5.1). Показано, что необходимо использовать восьмикратный избыток этиленимина в расчете на одну сульфгидрильную группу [12]. При низких рН наблюдается единственная побочная реакция алкилирования остатков метионина [91]. В связи с этим следует избегать подкисления реакционной смеси до полного удаления алкилирующего реагента. Более подробно метод рассматривается в гл. 2.

3.4.2.3. Другие реакции алкилирования. Для получения кислотоустойчивого остатка 5-пиридилэтилцистеина используют 4-винилпиридин [26]. Применение в качестве алкилирующего реагента 2-бромоэтилтриметиламмонийбромида приводит к получению производного цистеина, также устойчивого в условиях кислотного гидролиза и в условиях автоматического секвенирования [45]. Более подробно метод рассматривается в гл. 2.