Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и полипептидных цепей
Методы идентификации олигомеров
Гель-фильтрация

При гель-фильтрации разделение белков происходит главным образом по размерам белковой глобулы [6, 59]. В настоящей главе рассматривается хроматография на открытых колонках, хотя сегодня в связи с созданием новых колонок, приборов, методов набивки более важным методом является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ; см. гл. 6). Вместе с тем принципы разделения на открытых и закрытых колонках полностью идентичны.

Гель-фильтрацию проводят на колонках, заполненных частицами набухшего геля, имеющими поры определенного диаметра. Общий объем столбика геля обозначают V_t. Общий объем можно найти расчетным путем по форме колонки или же экспериментально по объему заполняющей ее воды. В процессе элюирования крупные молекулы, не проникающие в гранулы геля, перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем, находящимся между гранулами, и элюируются в виде узкой зоны. Объем элюента, соответствующий появлению этой зоны, обозначают v₀ (свободный объем). Менее крупные молекулы проходят через колонку не так быстро, так как они проникают в гранулы геля и их выход с колонки занимает продолжительное время. Поскольку степень диффузии в гранулы геля зависит от размеров молекул, вещества элюируются с колонки в порядке уменьшения их молекулярной массы. Молекулярная масса М исследуемого белка определяется путем сравнения объема элюирования V_e с аналогичным параметром для белков-маркеров. Этому вопросу посвящены исчерпывающие обзоры [1, 59] и проспекты фирмы Pharmacia [134].

1.2.2.1. Методики. Для получения удовлетворительных результатов необходимо использовать хроматографические колонки соответствующих размеров и подходящей конструкции. Такие колонки выпускаются фирмой Pharmacia (Швеция). Аналитические эксперименты проводят в колонках диаметром —15 мм, препаративные — в колонках диаметром 25—50 мм. Длина колонок составляет 500—1000 мм; если позволяет жесткость гранул геля используются колонки и большей длины. Кроме того, необходимы также фракционный коллектор, перистальтический насос и проточный денситометр.

Для хроматографических экспериментов подбирают гель с такими свойствами, чтобы зона исследуемого белка приходилась на середину профиля элюирования. Пористый носитель готовят на основе декстрана, акриламида и/или агарозы (с различной степенью сшивки), позволяющих разделять вещества с разными молекулярными массами. Агарозные гели (сефароза, биогель А) используют для фракционирования крупных белков с молекулярной массой вплоть до нескольких миллионов. Пулем соответствующей обработки агарозы получают сефарозу Cl (поперечно-сшитую), которая обладает достаточной жесткостью и допускает высокие скорости элюирования. Белки с молекулярной массой <1 000 000 фракционируют на сефадексе, биогеле Р или ультрагеле (фирма LKB). Снижение степени сшивки уменьшает жесткость геля и допустимую скорость элюирования, но увеличивает предел исключения по молекулярной массе. Более прочный гель (сефакрил), позволяющий проводить элюирование при более высоких скоростях (5—10-кратных), получают сшивкой аллилдекстрана N,N'-метиленбисакриламидом [89, 123].

Для получения наилучших результатов рекомендуется следовать стандартным методикам [134]. Высушенные гранулы геля выдерживают (или автоклавируют) в рабочем буфере в течение трех суток. Гели, поставляемые в виде суспензий, например сефакрил, промывают рабочим буфером и готовят суспензию в этом буфере. В колонку наливают немного буферного раствора, а затем осторожно по стенке переносят деаэрированную суспензию гранул геля. На пористую пластинку в нижней части колонки можно предварительно поместить небольшой слой жесткого геля сефадекса G-25, что позволит исключить забивание пластинки обломками гранул при работе на мягких гелях. Если объем суспензии превышает объем колонки V_t, то колонку наращивают. При набивке колонки скорость потока жидкости (буфера) может быть несколько выше, чем при последующем фракционировании, однако скорость потока и гидростатическое давление не должны превышать величин, рекомендованных фирмами-изготовителями. После формирования столбика геля через колонку пропускают не менее двух объемов рабочего буферного раствора. При использовании длинных колонок поток элюента рекомендуется подавать снизу вверх. С этой целью колонки снабжают специальными приспособлениями (фирмы Pharmacia, LKB, Wright).

Обычно используют буферные растворы с pH 6:8 и ионной силой >0,1 (например, 0,1 М трис-НСl — 0,1 М NaCl, pH 8,0); иногда в зависимости от свойств исследуемого белка приходится изменять параметры буфера, например увеличить ионную силу с тем, чтобы воспрепятствовать агрегации олигомеров. Однако в случае сефарозы эффективность разделения зависит от концентрации солей и pH [104]. Хроматографию на сефакриле рекомендуется вести при ионной силе >0,5 или при pH 5,5, поскольку этот гель проявляет слабые ионообменные свойства [191.

Постоянную скорость элюирования задают с помощью перистальтического насоса. Элюат, собираемый на фракционном коллекторе, анализируют в потоке или выборочно по фракциям па содержание белка, для чего обычно регистрируют изменение оптической плотности при 280 нм. Другие методы детектирования используют при отсутствии в белке хромофоров (остатков триптофана и тирозина), при работе на микроуровне или при слишком высоком поглощении при 280 нм, например благодаря присутствию кофактора. В этих случаях можно определять оптическую плотность при 220 нм, интенсивность флуоресценции или радиоактивность (при работе с мечеными белками) [14, 161]; наконец, при анализе белковых фракций можно использовать химическую модификацию (разд. 1.4.5.1). Например, определенные объемы (аликвотные части) отдельных фракций можно подвергнуть щелочному гидролизу и последующему анализу по реакции с нингидрином. Для обнаружения белков можно использовать реакцию Лоури или реакцию связывания красителя. Последний метод вполне можно рекомендовать как наиболее простой и чувствительный, причем этому определению не мешает присутствие химических реагентов. Кроме того, состав фракций можно определять с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Свободный объем V₀ обычно определяют по объему элюирования голубого декстрана 2000 (фирма Pharmacia), суспензии вируса табачной мозаики, ферритина или других объектов с высокой молекулярной массой, не проникающих в гранулы геля. Теоретически V₀ составляет 35% полного объема столбика геля V_t. Получение хорошо образованной (неразмытой) зоны синего декстрана служит критерием качества набивки колонки. В качестве маркера готовят раствор голубого декстрана (1 мг/мл) или белка (5—20 мг/мл) в буферном растворе, содержащем 10% (масс./об) сахарозы (плотность образца должна быть выше плотности элюирующего буфера). Образец маркера аккуратно наносят на колонку с помощью шприца или крана с дозирующей петлей. С целью уменьшить сорбцию голубого декстрана на сефадексе и сефарозе рабочий буфер должен иметь pH >5, а при работе на сефакриле — рН≥7. Объем образца не должен превышать 1—2% общего объема геля V_t. По завершении эксперимента определяют объем элюирования V_e исследуемого белка (по максимуму поглощения на графике оптическая плотность — объем элюирования). В случае превышения рекомендованного оптимального объема образца на кривой элюирования формируется плато, что затрудняет определение истинного значения V_e. Объем элюирования V_e можно найти по скорости элюирования, которую либо измеряют непосредственно в потоке или находят косвенным методом, измеряя количество элюата, собранного в единицу времени. Поскольку V_e пропорционален времени элюирования, в основу расчетов может быть положено время выхода с колонки исследуемого белка.

1.2.2.2. Анализ полученных результатов. При определении молекулярных масс методом гель-фильтрации для конкретной хроматографической колонки предварительно строят градуировочный график. На оси абсцисс откладывают объем элюирования или связанные с ним параметры, а на оси ординат молекулярную массу (в логарифмической шкале) известных белков. Наборы белков-маркеров фирмы Pharmacia включают рибонуклеазу (М 13 700), химотрипсиноген А (М 25 000), овальбумин (М 43 000), альбумин (М 67 000) или альдолазу (М 158 000), каталазу (М 232 000), ферритин (М 440 000), тироглобулин (М 669 000). Часто в расчетах используют величину V_c, однако более удобен коэффициент распределения К_av между жидкой фазой и фазой геля, поскольку этот параметр не зависит от объема колонки:

На рис. 1.2 приведен градуировочный график в координатах lgМ—K_avдля сефадекса G-200. Удобно также использовать график lg(100∙K_av) от N²/₃ (где N — число аминокислотных остатков в белках-маркерах), который имеет линейную форму. При градуировке колонки рекомендуется использовать такие белки-маркеры, которые обеспечивают хорошее разрешение и определение K_av С высокой точностью.

Параметры большинства белков вписываются в градуировочный график. Отклонения возможны в тех случаях, когда олигомер склонен к агрегации или диссоциации на мономеры или же не относится к глобулярным белкам [12]. Белки не должны сорбироваться в гранулах геля и порождать тем самым ложные зоны (пики), принимаемые за низкомолекулярные примеси. Известно, что белки с высоким содержанием ароматических аминокислот или олигосахаридных цепей сорбируются на сефадексе. Потери белка на колонке по причине выпадения в осадок или сорбции можно оценить, сопоставляя суммарное содержание белка (по поглощению при 280 нм) в элюате и исходном образце, нанесенном на колонку.

РИС. 1.2. Градуировочный график для сефадекса G-200, построенный с использованием белков-маркеров фирмы Pharmacia (из методического руководства фирмы).