Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Дисульфидные связи
Расщепление полипептидной цепи до коротких цистинсодержащих пептидов
Гидролиз трипсином и химотрипсином

После инкубации белка с пепсином по методике, описанной в разд. 4.4.2, реакционную смесь подщелачивают до pH 6,5 и инкубируют с трипсином (при соотношении фермент: субстрат = 1:25) при 25 °С в течение 8 ч [41], а затем с химотрипсином при соотношении фермент : субстрат = 1 : 100. Реакцию прерывают путем подкисления конц. НСl до pH 2. Степень гидролиза пептидных связей определяют по увеличению содержания свободных аминогрупп, используя реакцию с нингидрином или о-фталевым диальдегидом. Хорошие результаты получены при проведении гидролиза при 40 C [30]. Дополнительные сведения о проведении ферментативного гидролиза приводятся в разд. 3.6.1.

Иногда гидролиз трипсином проводят при нейтральном или слабощелочном значении pH, однако при этом необходимо доказать, что не происходит дисульфидного обмена. Фрагменты человеческого иммуноглобулина IgG (полученные при расщеплении белка бромоцианом) инкубировали с трипсином (2%) при pH 7,2 в течение 4 ч [19]. При гидролизе в присутствии избытка [С¹⁴] иодоацетамида показано, что белок не содержит нестабильных дисульфидных связей. В аналогичных условиях проводили триптический гидролиз фрагмента иммуноглобулина IgG (полученного при гидролизе белка пепсином), однако в отсутствие контроля за дисульфидным обменом [42]. Положение двух из четырех дисульфидных связей кардиотоксина яда кобры определено по строению цистинсодержащих пептидов, полученных при гидролизе белка трипсином при pH 7 в течение 24 ч

[30]. Дополнительные сведения приводятся в разд. 3.5.1.