Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Дисульфидные связи
Фракционирование цистинсодержащих пептидов
Обнаружение цистинсодержащих пептидов

При разделении и очистке цистинсодержащих пептидов необходимо располагать избирательным методом обнаружения. Широкое применение находит определение аминокислотного состава фракций после окисления пептидов надмуравьиной кислотой [41]. По наличию в пептиде остатка цистеиновой кислоты выявляют фракции, содержащие цистин. Показано, что сера в частично окисленном состоянии обесцвечивает раствор иодоплатината [16]. Эта реакция может использоваться как быстрый и чувствительный тест на дисульфиды, хотя аналогичную реакцию дает сера в виде тиолов и тиоэфиров. Чувствительный флуориметрический метод обнаружения основан на тушении флуоресценции при взаимодействии дисульфидов с флуоресцеинмеркуриацетатом в основной среде [26]. К сожалению, методика плохо воспроизводится.

4.5.2.1. Дисульфидный анализ [1|. Методика хорошо воспроизводится и может быть автоматизирована. Раствор пептида (и том мисле фракции после хроматографии) смешивают с равным объемом 6 М NaОН и инкубируют в течение ~30 мин. Реакцию останавливают путем добавления при энергичном перемешивании 0,3 мл 2 М фосфорной кислоты, содержащей 2Х10^-3 М ЭДТА. К полученному раствору (pH 6,0—7,0) добавляют 0,1 мл раствора ДТНБ (1,0 мг/мл в 0,02 М ацетате натрия, pH 5,5) и определяют поглощение при 412 нм. ЭДТА связывает ионы металлов, катализирующие окисление тиолов и тем самым стабилизирует окраску. Тем не менее спустя 60 мин поглощение падает на 1—2%. При построении градуировочного графика используют глутатион (0—2,5X10^-2 моль/л).