Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Молекулярные основы и механизмы наследственности
Организация генетического аппарата клетки

Развитие представлений о ДНК как о веществе, в котором зашифрована наследственная информация клетки, осуществлялось в истории биохимии на протяжении примерно двадцати лет в ходе нескольких этапов. Причиной та­кого длительного спора между исследователями в отношении одного из глав­ных вопросов естествознания послужила, с одной стороны, консервативность взглядов на структуру нуклеиновых кислот как на «просто организованные молекулы». При недостаточной их изученности полагалось, что ДНК и РНК представляют собой полимеры, в которых многократно повторяются тетра­нуклеотиды. В то же время белковые молекулы стали исследоваться раньше других клеточных макромолекул, и к 1928 г. в изучении их организации уда­лось достичь определенного прогресса: было известно, что в их составе при­сутствует, как минимум, 20 аминокислот, которые чередуются в произволь­ном порядке, определяя огромное количество вариантов строения полипепти­дов.

История становления постулата «ДНК — носитель наследственной ин­формации» показательна с точки зрения изящества человеческой мысли, а также проливает свет на многие закономерности процессов наследования признаков организмами и достойна изучения.

Первым прямым доказательством генетической роли ДНК послужили эксперименты Ф. Гриффита (1928 г.) по трансформации пневмококков. Гриффит работал с двумя типами штаммов Diplococcus pneumoniae: S- формами, образующими на агаризованных средах гладкие, блестящие (от англ. smooth — гладкий) колонии, и R-формами, характеризующимися шеро­ховатой (от англ. rough — шероховатый) поверхностью колоний. S-формы были высоковирулентными для мышей и вызывали у них пневмонию. Однако убитые нагреванием до 65° С, пневмококки S-формы не приводили к болезни и гибели мышей. R-формы были низковирулентными и редко вызывали забо­левание мышей.

Гриффит обнаружил, что если мышей заразить смесью живых R-форм и убитых нагреванием (до 65° С) S-форм, то животные заболевают, а из их крови можно выделить жизнеспособные S-формы пневмококков, причем того же серотипа, что и убитые нагреванием S-формы. Это наблюдение позволило Гриффиту сделать вывод о явлении «трансформации» в организме мыши бактерий одного типа (R) в бактерии другого типа (S), а трансформирующим фактором в этом случае должно было выступать вещество, определяющее наследственные свойства и содержащееся в убитых нагреванием клетках. Поскольку при используемой температуре (60—65 °С) белок подвергается денатурации, Гриффит предположил, что трансформирующим фактором, очевидно, является не белок, а ДНК.

Со времен экспериментов Гриффита данный метод переноса генетической информации называется трансформацией. Позже стало известно, что харак­тер клеточной поверхности пневмококков определяется двумя аллелями гена: аллель S контролирует способность клетки формировать полисахаридную капсулу, придающую гладкую поверхность колониям и защищающую пнев­мококков от иммунной системы мыши; если в клетке присутствует аллель R, то капсула не образуется, и клетки легко распознаются и уничтожаются им­мунной системой хозяина.

В свое время результаты экспериментов и выводы Гриффита, как выхо­дящие за рамки традиционных представлений об этих процессах, не были приняты научной общественностью. Понадобилось воспроизведение похожих манипуляций in vitro, которое осуществили в 1944 г. американские исследо­ватели Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти. Эти ученые трансформировали расту­щую культуру пневмококков R-типа выделенной из клеток S-штамма ДНК. Оказалось, что некоторые бактерии приобретали способность синтезировать полисахаридную капсулу и, соответственно, патогенность для мышей. При этом единственным фактором, способным сообщить R-клеткам данное свой­ство, была очищенная ДНК. Кроме того, в данных экспериментах было выяв­лено, что на трансформацию не оказывают влияния протеолитические фер­менты, и наоборот, обработка трансформирующего фактора нуклеазами при­водила к предотвращению процесса трансформации. Наконец, из экспери­ментов следовало, что возникающие в результате трансформации бактерии S-типа обладают способностью передавать приобретенное свойство (синтез капсульных полисахаридов) дочерним клеткам. Полученные американскими учеными доказательства роли ДНК в хранении и передаче наследственной информации носили фундаментальный характер и вошли в историю, однако и они не были оценены сразу по указанным выше причинам. Кроме того, изу­чение основ наследственности в 1944 г. только начиналось и еще не было точно установлено, что бактерии обладают генами, во всех отношениях сход­ными с генами высших организмов.

Решающим доказательством в пользу генетической роли ДНК стали экс­перименты, осуществленные Альфредом Херши и Маргарет Чейз в 1952 г. Им удалось доказать, что носителем наследственной информации у бакте­риофага Т2 является ДНК. Суть экспериментов сводилась к следующему. Одну культуру клеток кишечной палочки выращивали на среде, содержащей радиоактивные изотопы фосфора (³²Р), а другую — в присутствии изотопов серы (³⁵S), в результате чего эти изотопы включались в содержимое клеток. Затем каждую из меченых бактериальных культур использовали для получения лизата Т2. Получали разные лизаты меченных изотопами фагов: в одном из них содержались частицы Т2, у которых ³⁵S включался в состав белка (капсида), а в другом - Т2 с ³²Р в составе ДНК. Радиоактивные метки позво­ляли проследить пути белка и ДНК фага при его репродукции.

Литический цикл начинается с прикрепления фаговой частицы к клеточ­ной поверхности, и через определенное время фаговая ДНК инъецируется в клетку. Это подтверждалось результатами центрифугирования суспензий на отмеченных стадиях: вначале вместе с бактериями осаждались и фаги (³⁵S и ³²Р регистрировался в осадке). Однако через определенное время бульшая часть меченного изотопом серы белка может быть отделена от клеток при встряхивании суспензии, при этом бульшая часть меченной изотопом фосфо­ра ДНК не отделяется от бактерий и обнаруживается в осадке. Это дает осно­вание предполагать, что ДНК оказывается уже внутри клеток.

Удаление из культуры пустых фаговых оболочек («теней») не оказывает влияния на дальнейшие события: бактерии лизируются, и из них выходит фаговое потомство точно так же, как и в случае, если «тени» остаются на по­верхности клеток. Оказалось, что удаление «теней» сопровождается удалени­ем не менее 80 % ³⁵S, а основная масса ³²Р остается в клетках и в дальнейшем (при репродукции фага) передается потомству. Таким образом, очевиден вы­вод, что именно ДНК, а не белок определяет процесс репродукции фага в клетках.

Эксперимент Херши и Чейз послужил решающим доказательством гене­тической роли ДНК и привлек внимание к работам, выполненным на пневмо­кокках несколькими годами ранее. Этому способствовало несколько причин: к 1952 г. исследование структуры нуклеиновых кислот достигло больших ус­пехов и было опровергнуто представление об этих молекулах как о консерва­тивных; данный эксперимент был осуществлен на бактериофаге, относитель­но характера наследования признаков которого было хорошо известно, что он аналогичен таковому для высших организмов; наконец, для фага Т2 было продемонстрировано существование мутаций и так же, как у высших орга­низмов, описана рекомбинация мутантных генов.

Дополнительным доказательством генетической роли ДНК явилось обна­ружение инфекционных свойств у очищенного препарата ДНК вируса табач­ной мозаики.