Основы биохимической инженерии Часть 1 - Бейли Дж., Оллис Д. 1989

Стехиометрия и энергетика метаболических превращений
Стехиометрия клеточного роста и образования продуктов метаболизма
Стехиометрия процессов образования продуктов метаболизма

Множество конечных продуктов метаболизма выделяется клеткой в питательную среду или аккумулируется в клетке. В соответствии с особенностями стехиометрии процессы образования продуктов метаболизма удобно подразделить на четыре перечисленных ниже типа; первые три типа отвечают классификации путей анаэробного метаболизма, впервые предложенной в 1955 г. Гэйденом-младшим.

1. Основной продукт метаболизма является результатом первичного энергетического обмена. Примером может служить образование этанола в ходе анаэробного роста дрожжей.

2. Образование основного продукта метаболизма не связано непосредственно с энергетическим обменом, как, например, при биосинтезе лимонной кислоты при аэробном культивировании плесеней.

3. Конечный продукт является вторичным метаболитом. В качестве примера можно привести биосинтез пенициллина, образующегося в аэрируемой культуре плесени.

4. Биотрансформация. Здесь конечный продукт метаболизма образуется из субстрата в результате одной или нескольких реакций, катализируемых клеточными ферментами. Примером может служить гидроксилирование стероидов.

Процессы первого типа характеризуются относительно простой стехиометрией, что связано со сравнительно постоянной величиной отношения количества образующегося метаболита к количеству накопленной клеточной массы и утилизированного субстрата. В этом случае процессы утилизации субстрата, синтеза биомассы и образования конечного продукта метаболизма формально можно выразить одним уравнением химической реакции, если, например, к правой части уравнения (5.49) добавить продукт метаболизма СН_vО_w:

(Аналогичным путем можно выразить стехиометрию синтеза азотсодержащих продуктов метаболизма.)

Нетрудно получить и выражение для соответствующего экономического коэффициента, если учесть, что в этом параметре количества веществ должны быть выражены в молях. Так, если субстратом является глюкоза, молекула которой содержит шесть атомов углерода, то в реакции (5.57) будет участвовать а'/6 молекул глюкозы. Аналогично если в молекуле продукта метаболизма содержится n_р атомов углерода, то в результате реакции (5.57) образуется f'/n_p его молекул. Следовательно, молярный коэффициент Y_P/S (число молей продуктов метаболизма, образующегося из 1 моль утилизированного субстрата) составляет

Здесь n_s — число атомов углерода в молекуле субстрата.

Простая стехиометрия уравнения (5.57) неприменима к метаболитам второго типа, количество которых не обязательно должно быть пропорциональным количеству утилизированного субстрата или приросту клеточной массы. В этом случае стехиометрию процесса можно выразить только с помощью отдельного уравнения реакции образования продукта метаболизма. Интересно проследить за стехиометрией реакций, уравнения которых получены путем введения стадии образования продукта метаболизма в приведенные выше уравнения реакций роста клеток (5.53) — (5.56):

Образование продукта метаболизма:

Здесь коэффициентом 2 обозначена часть углерода субстрата, используемая для образования продукта метаболизма и найденная экспериментально в последнем. Генерируемое в процессе биосинтеза продукта метаболизма число молекул АТР обозначено коэффициентом е_р; этот коэффициент может принимать и отрицательные значения, если в процессе образования продукта метаболизма АТР не синтезируется, а, напротив, расходуется. Аналогично если коэффициент (-у_s—zy_p) имеет отрицательное значение, то это означает, что в процессе образования продукта метаболизма используются восстанавливающие эквиваленты NADH (или NADPH; на принятом здесь довольно невысоком уровне детализации механизмов путей метаболизма нет смысла различать эти два агента).

Способ описания стехиометрии образования метаболитов 3 и 4 зависит от природы субстратов и продуктов метаболизма. В этих случаях образование последних обычно никак не связано с клеточным ростом. Накопление вторичных метаболитов определяется кинетическими факторами и активностью клеток.

Изучение стехиометрии образования продуктов метаболизма позволяет сделать ряд важных с точки зрения инженера-технолога выводов. Например, с помощью стехиометрических расчетов можно оценить максимально возможный выход продукта метаболизма, а эти данные в свою очередь могут оказаться очень полезными в предварительном экономическом анализе технологического процесса (см. гл. 12). В качестве первого примера рассмотрим анаэробный процесс превращения глюкозы в этанол. (Приведенные выше реакции аэробного метаболизма могут быть применены и для изучения анаэробных процессов, если во всех реакциях опустить О₂ и стадии окислительного фосфорилирования.) Очевидно, что оптимальным вариантом является использование всего субстрата только для образования продукта метаболизма. Если принять, что рост клеток пренебрежимо мал, то уравнение (5.57) в нашем случае принимает очень простую форму:

СН₂О → ¹/₃СO₂ + ²/₃СН₃СO_0,5 (5.60)

Отсюда следует, что в идеальном варианте продукт метаболизма будет содержать две трети углерода утилизированного субстрата. В соответствии с уравнением (5.58) высший предел молярного коэффициента составит: (Y_P/S)_mах = (²/₃)(⁶/₂) = 2.

Такой же подход может быть использован и в случае образования метаболитов всех других типов, в том числе и при одновременном биосинтезе нескольких продуктов метаболизма. Предельное значение выхода данного продукта метаболизма можно определить, приняв, что одновременно с ним не образуются новые клетки или другие метаболиты. Например, по уравнению реакции биосинтеза пенициллина из соединений-предшественников:

легко определить максимально возможный выход пенициллина, составляющий 1,2 г на 1 г глюкозы. В реальных промышленных процессах выходы намного ниже (около 0,1 г/г), что свидетельствует о возможности дальнейшего совершенствования и технологического процесса, и микроорганизма-продуцента. Малая величина реального выхода продукта метаболизма по сравнению с максимальной расчетной величиной указывает на то, что значительное количество субстрата расходуется на рост клеток, на их поддержание или на синтез других веществ.

Изучение зависимости между энергетическим обменом и биосинтезом продуктов метаболизма в том виде, в каком эти процессы выражаются уравнениями (5.53) — (5.56) и (5.59), может дать полезные сведения о влиянии затрат на поддержание клеток на выходы продуктов метаболизма. Предположим, что в анаэробных условиях в среде, содержащей в качестве источника азота аммиак, из глюкозы образуется этанол. Единственным источником АТР здесь является субстратное фосфорилирование [уравнение (5.536)]. В такой ситуации относительно высокие затраты субстрата на поддержание клеток приведут к тому, что сравнительно большие количества глюкозы будут расходоваться в реакциях диссимиляции. Это в свою очередь приведет к регенерации большего количества NADH, не использующегося в сколько-нибудь значительных количествах в реакции биосинтеза [уравнение (5.55а)], поскольку степени восстановленности субстрата и биомассы примерно одинаковы. Восстанавливающие эквиваленты будут использоваться в образовании продукта метаболизма по уравнению реакции (5.59а), что приведет к его накоплению в среде, поскольку степень восстановленности этанола выше степени восстановленности субстрата (глюкозы). Напротив, в аэробных условиях, когда целью процесса часто является синтез метаболитов третьего или четвертого типов, повышение расхода субстрата на поддержание клеток приводит к снижению выхода продукта метаболизма за счет интенсификации утилизации субстрата при выработке энергии.

Очевидно, метаболические превращения можно описывать не только уравнениями (5.53) — (5.56) и (5.59). Эти уравнения должны быть модифицированы, например, в тех случаях, когда одновременно утилизируется несколько источников углерода и (или) азота или когда продукт метаболизма содержит азот. Стехиометрические уравнения могут описывать и превращения по какому-либо определенному пути метаболизма. Действительно, сочетание стехиометрического анализа и экспериментального определения количеств использованного субстрата и образовавшегося метаболита успешно применялось для оценки потоков веществ по параллельным и разветвляющимся путям метаболизма. Более детально альтернативные стехиометрические уравнения рассмотрены в упражнениях, поскольку принципы и методы их построения очень близки принципам, изложенным в этом разделе. Обсуждение стехиометрии мы продолжим в следующем разделе, посвященном проблеме выделения тепловой энергии в метаболических процессах.