Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Белки с гормональной активностью
Инсулин

Инсулин — гормон поджелудочной железы — быстро разрушается протеолитическими ферментами этой железы, если саму железу или ее экстракт хранить в течение некоторого времени. Разрушение инсулина протеолитическими ферментами поджелудочной железы и было причиной неудач прежних исследователей, пытавшихся получить активный экстракт этой железы.

Активные экстракты были получены Бантингом и Бестом [21], которые затормозили действие трипсина, применив в качестве растворителя подкисленный этиловый спирт. Действие трипсина можно также предотвратить, добавляя к экстрактам поджелудочной железы пикриновую кислоту [22]. Инсулин устойчив к действию разведенных кислот.

¹ Имеется много оснований считать, что сущность действия тиреоглобулина и тироксина заключается в активировании функции ферментов. В настоящее время известен уже ряд ферментных систем, в том числе многих окислительных, активность которых значительно увеличивается при введении гормонов щитовидной железы. Согласно положению, выдвинутому Б. И. Гольдштейном и его сотрудниками, тироксин активизирует деятельность ферментов путем восстановления дисульфидных групп в их молекуле в сульфгидрильные. Увеличение количества определяемых сульфгидрильных групп после введения в организм животных гормонов щитовидной железы было установлено для белков печени и мышц (Б. И. Гольдштейн, М. Б. Гинзбург, Е. А. Колли, Е. Ю. Милырамм и О. С. Скловская, Биохимия, 11, 447, 1946). Увеличение количества этих групп в препаратах d-аминокислотоксидазы после введения крысам тироидина было констатировано А. В. Азявчик, причем было показано, что одновременно увеличивается активность этих препаратов (А. В. Азявчик, Диссертация, Москва, 1952). Усиление активности протеолитических и окислительных ферментов, из которых очень многие являются так называемыми сульфгидрильными ферментами, может объяснить ряд физиологических свойств гормонов щитовидной железы. — Прим. ред.

Кристаллы инсулина получают путем растворения неочищенных препаратов в уксусной кислоте с последующей осторожной нейтрализацией раствора аммиаком и пиридином [23, 24]. Кристаллизация протекает лучше при добавлении сапонина [25]. В 1 мг чистого кристаллического препарата содержится примерно 20 интернациональных единиц инсулина. У некоторых видов рыб островки Лангерганса образуют в поджелудочной железе отдельный орган. У этих рыб инсулин найден только в этом органе и отсутствует в остальных частях железы [26].

Молекулярный вес растворенного инсулина равен примерно 48 000 [27, 28], однако он варьирует в зависимости от концентрации раствора и его pH. При pH меньше 4 и больше 7,5 происходит диссоциация молекул инсулина на меньшие единицы [27], молекулярный вес которых равен приблизительно 12 000. Рентгеноструктурный анализ показал, что кристаллы инсулина состоят из трех подобных субъединиц; следовательно, эквивалентный вес кристаллического инсулина равен 36 000. При электрофорезе инсулин ведет себя как однородное вещество [29]. Изоэлектрическая точка инсулина находится вблизи pH 5,3—5,8 [28].

При изучении аминокислотного состава инсулина было обнаружено, что инсулин содержит очень много серы. Детальный анализ показал, что в состав молекулы инсулина входит примерно 12% цистина и цистеина, 10% лейцина и 12% тирозина [30] (см. табл. 1). Другой характерной особенностью аминокислотного состава инсулина является наличие в нем большого числа свободных аминогрупп, значительно превышающего число содержащихся в инсулине молекул лизина. В результате полного анализа аминокислотного состава инсулина была установлена следующая формула: арг₂, гис₄, лиз₂, глу₁₅, асп₆, гли₇, ала₇, вал₈, лей₁₂, изолей₃, про₃, тир₉, фенилала₆, сер₆, трип₂, цис (SS/2)₁₂, аммиак₁₂ [31]. Аминогруппы инсулина, очевидно, обусловливают в определенной степени его физиологическую активность, так как после обработки формальдегидом эта активность теряется [32].

Инактивацию инсулина вызывают также некоторые восстановители, например цистеин [34], тиогликолевая кислота [33] или лейкоформа метиленового синего [35]. Действие указанных соединений связано, по всей вероятности, с расщеплением дисульфидных групп, каждая из которых превращается в две сульфгидрильные группы [33]. Такое же действие на дисульфидные группы оказывает и йодная кислота, но в этом случае образуются не сульфгидрильные группы, а сульфоновые (—SО₃H) [36]. При обработке инсулина серной кислотой образуются эфиры инсулина, которые сохраняют большую часть гормональной активности [37]. Если кристаллический инсулин подвергнуть действию кристаллического трипсина, то его активность уменьшится лишь незначительно. Это связано с тем, что при действии трипсина гидролизуются лишь одна или две пептидные связи на молекулу [38]. В то же время пепсин и химотрипсин легко расщепляют инсулин [39].

Если инсулин алкилируется при помощи динитрофторбензола (см. стр. 125) и затем гидролизуется, то на каждую единицу инсулина, имеющую молекулярный вес 12 000, образуются две молекулы динитрофенилглицина и две молекулы динитрофенил- фенилаланина. Это указывает на то, что каждая из этих единиц построена из четырех пептидных цепей, содержащих на концах глицин и фенилаланин [40]. Сенджеру [41] удалось выделить из инсулина два полипептида А, содержащих в качестве концевых групп остаток глицина, и два полипептида В, имеющих на концах группы фенилаланина. Из полипептида А при обработке динитрофторбензолом получаются следующие менее крупные пептиды: ДНФ-глицилизолейцин (ДНФ обозначает динитрофенил), ДНФ-изолейцилвалин, ДНФ-глицилизолейцилвалилглицин и ДНФ-тирозин. Полипептид А не содержит аргинина, гистидина, фенилаланина и треонина. При такой же обработке из полипептида В образуются ДНФ-фенилаланилвалин, ДНФ-фенилаланилвалиласпарагиновая кислота, ДНФ-фенилаланилвалиласпарагилглутаминовая кислота, ДНФ-лизилаланин и треонил-ДНФ-лизилаланин. Эти данные убедительно показывают, что молекула инсулина построена из различных пептидов, соединенных между собой дисульфидными связями остатков цистина. Аргинин и гистидин, которые составляют наибольшую часть основных аминокислот инсулина (см. табл. 1), содержатся только в некоторых из этих пептидов [42].

Инсулин легко соединяется с двухвалентными металлами, особенно с цинком, кобальтом и кадмием; соединение инсулина с цинком легче кристаллизуется, чем чистый инсулин [43]. Весьма большое клиническое значение имеет способность инсулина образовывать комплексы с протаминами. Гормональная активность такого комплекса падает не так быстро, как активность чистого инсулина [44].

Инсулин довольно устойчив к действию денатурирующих агентов и не денатурируется органическими растворителями и разведенными кислотами; денатурация не наступает также и при образовании мономолекулярных слоев [45]. Если инсулин нагревать в слабокислом растворе, то образуются неактивные фибриллы, которые затем вторично агрегируются в нерастворимые, имеющие форму шара образования [46]. Интересно отметить, что этот процесс обратим и что инсулин реактивируется при воздействии щелочей [46]. Инсулин не обладает антигенными свойствами и видовой специфичностью [47].

Инъекция инсулина понижает содержание сахара в крови и предупреждает потерю глюкозы и развитие ацидоза у диабетиков. Добавление инсулина к переживающей диафрагме крысы вызывает увеличение потребления диафрагмой глюкозы и пировиноградной кислоты [48]. Это действие, однако, нельзя обнаружить на экстрактах из диафрагмы [49]. По мнению некоторых авторов, последнее обстоятельство свидетельствует о том что инсулин меняет проницаемость клеток к веществам, участвующим в углеводном обмене [49].

При работе с продажными препаратами инсулина необходимо помнить, что они иногда содержат примеси, вызывающие начальную гипергликемию, т. е. повышение уровня сахара в крови [50].