Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Соединения белков с другими веществами
Соединения белка с небелковым компонентом

Природа сил, действующих в сложных белках, изучалась путем соединения белков с различными типами веществ, в частности с анионами и катионами. Соединение малых неорганических ионов с белками уже рассматривалось в гл. V (см. стр. 86). Там указывалось, что ионные группы белков соединяются с катионами кальция, анионами фосфата и другими неорганическими ионами путем образования солеобразных связей. Подобные же связи образуются и in vitro; так, например, инсулин легко соединяется с анионом роданистых солей [6].

Органические анионы и катионы соединяются с белком при помощи такого же типа электровалентной связи. Определенные методические преимущества представляет изучение соединения белков с окрашенными ионами. Если соединение с неокрашенными ионами может быть исследовано лишь при помощи очень трудоемких аналитических методов, то соединение белков с красителями можно изучать спектроскопически, так как процесс связывания ионов красителя сопровождается изменением окраски и спектра поглощения. Этим путем было количественно изучено соединение белков с метиловым оранжевым и другими подобными красителями [8, 9], а также с нитрофенолами [10]. Диализируя сывороточный альбумин против метилового оранжевого, удалось установить, что наибольшее число молекул красителя, связываемых одной молекулой белка, равно 22. Метиловый оранжевый является кислым азокрасителем:

анион сульфоната которого связывается с катионными группами белка, в частности с ε-аммонийными группами лизина [9]. При pH >12 основные группы лизина теряют свой положительный заряд (см. стр. 78) и количество связанного красителя уменьшается. Окраска раствора метилового оранжевого при постоянном pH изменяется от добавления белка, так как белок, соединяясь с анионами красителя, нарушает тем самым равновесие между анионами и недиссоциированными молекулами красителя [9]. Термодинамический анализ показывает, что изменение свободной энергии обратимой реакции

равно ∆F = —6411 кал на 1 моль красителя при 25° [8, 11]. Было установлено также, что ∆Н составляет — 2100 кал/моль [11]. При помощи подобного же анализа удалось показать, что 1 молекула сывороточного альбумина соединяется только с 6 молекулами о-нитрофенола, тогда как при реакции с м-нитрофенолом происходит соединение 1 молекулы альбумина с 24 молекулами, а при реакции с n-нитрофенолом — с 25 молекулами [10]. Из этих данных ясно, что характер соединения определяется положением реагирующих групп1. Белки могут образовывать соединения не только с ароматическими красителями, но также и с такими простыми анионами алифатического ряда, как анионы масляной, капроновой и каприловой кислот. Это было установлено путем электрофореза и подтверждается также тем, что анионы жирных кислот предохраняют от коагуляции белки, денатурированные нагреванием или другими способами [13].

Значительный интерес представляет то обстоятельство, что метиловый оранжевый, который легко соединяется с сывороточным альбумином, не образует соединений с у-глобулином, инсулином, пепсином и трипсином [11]. Лактоглобулин же способен связать небольшие количества метилового оранжевого [11]. Подобное различие в поведении отдельных белков говорит о том, что поверхность их глобулярных молекул образована различными молекулярными группами.

Денатурированный яичный альбумин соединяется очень прочно с азокрасителем конго красным, причем этот краситель предохраняет яичный альбумин от коагуляции при нагревании [14]. Анион красителя так прочно присоединяется к денатурированному белку, что продолжает оставаться в виде аниона, имеющего красную окраску, даже при pH 2, тогда как свободные анионы конго красного переходят в конго синий уже при значениях pH ниже 3—4. В бессолевых растворах конго красный образует с белками осадки [15]. Конго красный способен также связываться с нерастворимым белком — амилоидом, который при некоторых хронических воспалениях накапливается в печени, селезенке и других органах. Эта реакция используется для диагностики амилоидоза, так как введенный внутривенно краситель, связываясь амилоидом, быстрее исчезает из крови больных, страдающих амилоидозом, чем из крови других больных. Окрашивание амилоида конго красным представляет особый интерес также в том отношении, что соединение белок—краситель обладает двойным лучепреломлением, тогда как амилоид сам по себе этого свойства не обнаруживает [16].

¹ Соединение белков с трифеиилметановыми красителями было детально изучено А. Д. Брауном и его сотрудниками (А. Д. Браун, Диссертация, Ленинград, 1949; А. Д. Браун, Биохимия, 13, 409, 1948; ДАН СССР, 62, 263, 1948; 68, 757, 1949; Биохимия, 16, 399, 1951). В их работах было установлено, что способность многих белков обесцвечивать трифенилметановые красители (малахитовый зеленый, яркий зеленый и другие) обусловлена образованием соединений между этими красителями и белками, причем денатурированные белки обладают большей способностью связывать указанные красители, чем нативные. Красители присоединяются к сульфгидрильным группам белков. — Прим. ред.

Множество исследований было проведено над соединениями белков с анионными детергентами. Последние представляют собой алкилсульфоновые кислоты с длинной углеводородной цепью (RSO₃H) или эфиры алкилсерных кислот (ROSO₃H). В большинстве этих работ в качестве анионного детергента использовался додецилсульфат натрия (С₁₂Н₂₅∙ OSC₃Na). Анионные детергенты при значениях pH ниже изоэлектрической точки белка образуют с белками нерастворимые осадки. Поскольку изоэлектрическая точка большинства белков лежит около pH 5—6, осаждение анионными детергентами происходит при ясно кислой реакции и, очевидно, анионы детергента соединяются с катионными группами белка [17]. ß-Лактоглобулин соединяется с двумя молекулами додецилсульфата [18], образуя кристаллическое соединение. Однако если смешать белок с большим избытком детергента, то каждая белковая молекула соединится с очень большим числом анионов детергента. Так, например, 100 г желатины связывают более чем 1000 мМ додецилсульфата, хотя это количество желатины содержит только 90 мэкв катионных групп [19]. Для объяснения такого неожиданно высокого отношения детергент/белок было выдвинуто предположение, что с белком соединяются не отдельные молекулы, но многомолекулярные мицеллы детергента; можно предположить также, что наряду с образованием солеобразных связей детергент связывается с молекулой белка еще и силами, действующими между углеводородными цепями детергента и гидрофобными группами белка [21]. Образование нерастворимых соединений белков с анионными детергентами наблюдалось также в мономолекулярных пленках на поверхности раздела вода—воздух [22], причем эта реакция сопровождается денатурацией белка. При смешивании 4-процентного раствора яичного альбумина с 5-процентным раствором детергента в присутствии сульфата аммония наблюдалось образование нерастворимых нитей [23]. Осадки состоят, возможно, из чередующихся слоев белка и детергента [24]. Соединение белок—детергент растворимо в избытке детергента, что, повидимому, связано с возникновением комплекса, центром которого служит молекула белка, а поверхность образована анионными группами детергента [25]. Растворимые соединения белка с детергентом образуются также и в щелочных растворах [17, 25]. Их присутствие может быть обнаружено электрофоретически.

Подобные же соединения образуются между белками и кислыми азобелками. Если реакция происходит в межизоэлектрической зоне, т. е. в области pH между изоэлектрическими точками белка и азобелка, то образовавшийся комплекс выпадает в осадок [26]. Кислые азобелки приготовляют, соединяя белок с диазотированными аминофенилсульфоновыми кислотами; они содержат кислые сульфогруппы и при pH > 2 представляют собой анионы. Осадки белок—азобелок растворяются при pH > 8, так как при этом значении pH и белок, и азобелок представляют собой анионы. Осадки белок—азобелок растворимы также в избытке азобелка, аналогично тому, как осадки белок—детергент растворяются в избытке детергента.

Кроме указанных макромолекулярных анионов, белки образуют также соединения с анионами полисахаридных кислот, например кислот, содержащихся в пектине или гуммиарабике. Эти соединения также выпадают в осадок в межизоэлектрической зоне и растворяются в избытке аниона [27]. Осадки, образующиеся при соединении белков с этими фибриллярными анионами, имеют рыхлую гелеобразную структуру и представляют собой микроскопические капельки, а не твердую фазу. Такая форма осаждения, получившая название коацервации [28], обусловлена иммобилизацией больших количеств воды между фибриллярными анионами полисахаридных кислот.

Реакции, происходящие между белками и макромолекулярными анионами, имеют особое значение, так как они могут служить моделями соединения белков с нуклеиновыми кислотами, которые также представляют собой анионы с высоким молекулярным весом. Реакции нуклеиновых кислот с белками будут рассмотрены ниже (см. гл. XI). Забегая, однако, вперед, можно сказать, что нуклеиновые кислоты ведут себя так же, как и рассмотренные выше анионы, соединяясь с белками при помощи солеобразных связей и образуя осадки в межизоэлектрической зоне [29, 30]. Из сказанного ясно, что анионы должны наиболее охотно соединяться с теми белками, которые обладают основными свойствами. Лизоцим, белок основного характера, изоэлектрическая точка которого лежит при pH 10,5—11,0, соединяется в нейтральных растворах с нуклеиновыми кислотами, а также с анионными детергентами и метиловым оранжевым [31].

Соединение белков с органическими катионами изучалось значительно менее обстоятельно, чем соединение с анионами. Резко щелочные протамины дают осадки с глобулинами и с денатурированными (но не нативными) альбуминами. Эти осадки образуются в межизоэлектрической зоне, т. е. при щелочной реакции, при подкислении же они растворяются [32]. Они растворимы также в концентрированных растворах нейтральных солей. Это последнее явление обусловлено тем, что ионы солей, успешно конкурируя с ионными группами протамина за соединение с ионизированными группами белка, разрывают образовавшиеся связи белка с протамином [33].

В течение последних лет были синтетически приготовлены и катионные детергенты (обратные мыла), обладающие дезинфицирующим действием. Эти вещества соединяются с белками в межизоэлектрической зоне, т. е. в щелочных растворах. Большинство катионных детергентов имеют структуру где — галоидный ион, R — различные алифатические или циклические группы. Зефироль (зефиран), один из катионных детергентов, представляет собой хлорид додецилтриметиламмония; в щелочных растворах он образует с белками осадки, которые растворяются при кислой реакции, когда отрицательные СОО-группы белка утрачивают свой заряд [35, 36]. Эти осадки растворимы также в избытке катионного детергента [37]. Анализ осадков, полученных при действии дезогена (метасульфат толилдодецилтриметиламмония) на гемоглобин, показал, что молекула гемоглобина связывает свыше 300 катионов детергента; поскольку в молекуле гемоглобина содержится только 65 анионных групп, полагают, что к белковой молекуле присоединяются мицеллы катионного детергента [38].

Пока еще нет достаточных оснований утверждать, что дезинфицирующее действие катионных детергентов обусловлено именно тем, что они связывают бактериальные белки. Известно, что катионные детергенты соединяются также и с нейтральными полисахаридами и, следовательно, связывание ими полисахаридов, входящих в состав капсул бактерий, гоже может играть существенную роль в механизме дезинфицирующего действия.

В настоящее время нет сомнений в том, что анионные и катионные детергенты притягиваются к белкам при помощи ионизированных групп белковых молекул; однако весьма вероятно и то, что неполярные углеводородные цепи детергентов также принимают участие в образовании этих соединений. Неполярная углеводородная группа соединяется, повидимому, с неполярными группами белка, т. е. с алифатическими цепями аланина, валина, лейцина и изолейцина, с бензильной группой фенилаланина и с группами СН₂ пирролидинового кольца пролина. При помощи этих неполярных группировок белки соединяются с жирами и жирными кислотами [39], а также с простыми углеводородами. Так, например, было установлено, что 2-процентный раствор эдестина в 10-процентном хлористом натрии способен удержать в растворе 5 000 молекул пентана на одну молекулу белка [40]. Адсорбция кишечной стенкой полярных соединений с низким молекулярным весом (например, четыреххлористого углерода) обусловлена, возможно, тем же самым явлением, — рыхлым связыванием этих соединений белками.

Гидроксильная, сульфгидрильная, амидная и другие деионизированные полярные или способные к поляризации группы белковых молекул соединяются с полярными или с ионными группами других молекул при помощи электростатических сил. Многие лекарства, в том числе сульфамиды, также присоединяются к белковым молекулам посредством этих же связей. Изменение свободной энергии при соединении белков с сульфамидами равно ∆F = 4 000—5 000 кал/моль [41]. Пространственное расположение полярных группировок, вступающих в связь, оказывает большое влияние на силу связи. Чем лучше «пригнаны» друг к другу оба партнера, вступающие в соединение, тем меньше будет межмолекулярное расстояние между ними и тем сильнее окажется взаимное притяжение между их ионными или полярными группами [4]. Взаимное притяжение между антигенами и специфическими для них антителами обусловлено именно этим типом связи, — взаимным притяжением поверхностей, дополняющих друг друга (см. гл. XIV).

Конкурентное торможение обусловлено тем же эффектом, а именно: конкуренцией сходных по структуре молекул за соединение с одной и той же частью молекулы белка, форма поверхности которой является дополнительной к их форме. На этой основе можно объяснить действие некоторых антиметаболитов. Хороший пример подобного рода представляет конкуренция n-аминобензойной кислоты с сульфамидами. Причина этой конкуренции заключается в аналогичном пространственном строении обоих названных соединений:

Подобная же конкуренция между субстратами и ингибиторами (в ферментативных реакциях) и между антигенами и гаптенами будет рассмотрена в гл. XII и XIV.