БІОХІМІЯ - Лабораторний практикум - НАУ 2015
МОДУЛЬ I
БІОХІМІЧНІ КОМПОНЕНТИ КЛІТИНИ
Лабораторна робота 4
ВИЗНАЧЕННЯ ХІМІЧНИХ ПАРАМЕТРІВ ЖИРІВ
Мета роботи: дослідити основні хімічні параметри жирів — здатність до омилення, визначити їх кислотність, ефірне число, йодне число, пероксидне число; розрахувати вміст гліцеролу в жирі; порівняти декілька жирів за хімічними параметрами.
Основні теоретичні відомості
Жири або ліпіди — різноманітні за своєю будовою та функціями біоорганічні сполуки, яких об’єднує нерозчинність у полярних розчинниках (насамперед у воді) і розчинність в неполярних органічних розчинниках (ацетоні, хлороформі, діетиловому ефірі тощо). Жири розрізняються за зовнішнім виглядом, кольором, запахом, консистенцією, а також хімічними параметрами, які є їх специфічними характеристиками.
Числом омилення (ЧО) називають кількість гідроксиду калію в
1 мг, яка потрібна для нейтралізації всіх жирних кислот (вільних і тих, що входять до складу триацилгліцеролів), що містяться в 1 г жиру.
Кислотністю жиру, або кислотним числом (КЧ), називають кількість КОН, мг, яка потрібна для нейтралізації вільних жирних кислот, що містяться в 1 г жиру.
Ефірним числом (ЕЧ) називають кількість КОН, мг, яка потрібна для нейтралізації всіх утворених під час омилення триацилгліцеролів жирних кислот, що містяться в 1 г жиру. ЕЧ визначають за різницею між ЧО жиру та його КЧ.
Йодним числом (ЙЧ) називають кількість йоду, г, яка може прореагувати зі 100 г жиру. Це число відповідає кількості подвійних зв’язків ненасичених жирних кислот у жирі.
Пероксидним числом називають кількість 0,005 М розчину Na2S2О3 (мл), витрачену на титрування вільного йоду, що виділився під час окиснення КІ пероксидним угрупованням одного граму жиру. Також пероксидним числом називають:
- кількість грамів йоду, що виділяється з йодиду калію під впливом перекисів, які містяться в 100 г жиру;
- кількість грамів йоду, яка може прореагувати з активним воднем перекисів, які містяться в 100 г жиру;
- кількість йоду, еквівалентна кількості НІ, що прореагувала за стандартних умов з перекисними або гідроперекисними угрупованнями жиру, виражена у відсотках.
Обладнання: колби об'ємом 50 мл, зворотний холодильник, водяна баня, ваги, піпетки, бюретки, крапельниці.
4.1. Визначення числа омилення
Матеріали та реактиви: соняшникова або інша рослинна олія, будь-який твердий жир (наприклад, вершкове масло, маргарин, смалець), 0,1%-й спиртовий розчин фенолфталеїну, 0,5 M розчин НС1, 0,5 M спиртовий розчин КОН (готують 10 мл 10 М водного розчину КОН і потім розводять очищеним етанолом до необхідної концентрації, зберігають щільно закритим).
Порядок виконання роботи
В одну колбу вміщують 0,5 г твердого жиру або 0,5 мл олії (досліджувана проба), у другу — 0,5 мл води (контрольна проба). В обидві колби доливають по 15 мл спиртового розчину КОН і кип'ятять зі зворотним холодильником на водяній бані протягом
50 хв до повного омилення гліцеридів і нейтралізації вільних жирних кислот, потім охолоджують до 30—40 °С. В обидві колби додають по декілька крапель розчину фенолфталеїну і титрують теплим розчином НС1 до зникнення рожевого забарвлення (до нейтральної реакції).
Кількість міліграмів КОН, витрачену на нейтралізацію всіх жирних кислот, що містяться в 1 г жиру — число омилення (ЧО) визначають за формулою
ЧО = (B — A) f Q / a,
де (В — А) — різниця результатів титрування контрольного та досліджуваного зразків 0,5 М розчином соляної кислоти, мл;
f — коефіцієнт поправки на титр 0,5 М розчину НС1 (0,98);
Q — кількість КОН (28,05 мг), яка еквівалентна 1 мл 0,5 М розчину КОН, а — наважка досліджуваного жиру, г.
4.2. Визначення кислотного числа жиру
Матеріали та реактиви: соняшникова або інша рослинна олія, будь-який твердий жир (вершкове масло, маргарин, смалець), спирт, нейтралізований за фенолфталеїном, розчин КОН (0,1 М), 0,1 %-й розчин фенолфталеїну.
Порядок виконання роботи
До 1 г жиру додають 5 мл спирту, нейтралізованого за фенолфталеїном, добре перемішують для максимального розчинення вільних жирних кислот і титрують розчином КОН до появи рожевого забарвлення (забарвлення не повинно зникати протягом 0,5—1 хв).
Кількість КОН, мг, витрачену на титрування вільних жирних кислот, що містяться в 1 г жиру, визначають за формулою
КЧ = A f Q / а,
де А — об'єм 0,1 М розчину КОН, витрачений на титрування досліджуваної проби, мл; f — коефіцієнт поправки на титр 0,1 М розчину КОН (0,98); Q — кількість КОН (5,61 мг), еквівалентна 1 мл 0,1 М розчину КОН, а — наважка жиру; г.
4.3. Визначення йодного числа жиру
Матеріали та реактиви: соняшникова або інша рослинна олія, будь-який твердий жир (вершкове масло, маргарин, смалець), 0,1 М спиртовий розчин йоду, 1%-й розчин крохмалю, 0,05 М розчин Na2S2О3.
Порядок виконання роботи
Визначення йодного числа (ЙЧ) ґрунтується на реакції приєднання йоду за місцем подвійного зв'язку, яка перебігає за рівнянням
В одну колбу (досліджувана проба) вносять наважку жиру
0,1—0,2 г, у другу (контрольна проба) — 0,1 — 0,2 мл води, додають по 10 мл спиртового розчину йоду, перемішують і залишають на 15 хв. Через 15 хв уміст колб титрують розчином Na2S2О3 до появи жовтуватого забарвлення. Потім, додавши 1 мл розчину крохмалю, суміш титрують до зникнення синього забарвлення.
Йодне число визначають за формулою
ЙЧ = (В — A) f Q 100 / a 1000,
де (В — А) — різниця результатів титрування контрольного та досліджуваного зразків 0,05 М розчином гіпосульфіту натрію, мл; а — наважка досліджуваного жиру, г; f — коефіцієнт поправки на титр 0,05 М розчину Na2S2О3 (0,96); Q —кількість І2 (12,69 мг), еквівалентна 1 мл 0,05 М розчину Na2S2О3.
4.4. Визначення пероксидного числа жиру
Матеріали та реактиви: соняшникова або інша рослинна олія, будь-який твердий жир (вершкове масло, маргарин, смалець), згірклий жир, насичений розчин КІ, хлороформ, 0,005 М розчин Na2S2О3, 1%-й розчин крохмалю, льодяна оцтова кислота.
Порядок виконання роботи
Метод ґрунтується на здатності пероксидного угруповання жиру реагувати з КІ в кислому середовищі.
Реакція дуже чутлива, тому слід готувати контрольні проби, щоб уникнути помилки, спричиненої можливим утворенням йоду під час окислення КІ киснем повітря.
В одну колбу (досліджувана проба) вносять наважку жиру (1 г), у другу (контрольна проба) — 1 мл води, додають по 5 мл льодяної оцтової кислоти, по 6 мл хлороформу та по 1 мл свіжоприготованого насиченого розчину КІ, струшують протягом 5 хв, додають по десять крапель розчину крохмалю як індикатора і титрують розчином Na2S2О3.
Пероксидне число, тобто кількість 0,005 М розчину Na2S2О3, мл, витрачена на титрування 1 г жиру, дорівнює
C = (A — B) f,
де (А — В) — різниця результатів титрування досліджуваного та контрольного зразків 0,005 М розчином Na2S2О3; f — коефіцієнт поправки на титр 0,005 М розчину Na2S2О3 (0,96).
Оброблення експериментальних даних
Визначте ефірне число досліджуваних жирів.
Зважаючи на те, що для вивільнення однієї молекули гліцеролу необхідно витратити три молекули КОН, розрахуйте кількість гліцеролу в жирі (%) за формулою:
С = 96,02 ЕЧ 100 / 56,11 · 3 · 1000,
де 96,02 — молекулярна маса гліцеролу; ЕЧ — ефірне число жиру, мг; 56,11 — молекулярна маса КОН, 3 — коефіцієнт перерахунку; 1000 — кількість міліграмів в 1 г.
Побудуйте таблицю, у якій вкажіть хімічні параметри досліджуваних жирів, порівняйте рослинні та тваринні жири.
Контрольні запитання та завдання
1. Назвіть насичені, мононенасичені, поліненасичені вищі жирні кислоти. Напишіть їх структурні формули. Які вищі жирні кислоти складають вітамін F?
2. Від чого залежить консистенція жиру? Напишіть формулу рідкого жиру, реакцію утворення з нього твердого жиру.
3.Які сполуки нагромаджуються у згірклих жирах? У яких реакціях вони утворюються?
4. Для якого жиру — твердого чи рідкого — йодне число більше? Відповідь обґрунтуйте. Поясніть, чому при зберіганні жирів збільшується їх кислотне число.
5. Що таке прооксиданти та антиоксиданти? Які найважливіші природні антиоксиданти вам відомі?
6. Які ферментні системи в організмі знешкоджують перекисні сполуки?
7. Напишіть реакцію омилення триацилгліцеролу, назвіть реагенти та продукти реакції. Напишіть реакцію етерифікації між пальмітиновою, олеїновою, стеариновою кислотами та гліцерином. За яких умов вона є оборотною? Назвіть продукт реакції.
8. Напишіть структурні формули фосфатидної кислоти, найпоширеніших фосфоацилгліцеролів — фосфатидилетаноламіну, фосфатидилхоліну. Яку біологічну роль вони виконують? Які ще фосфоацилгліцероли вам відомі?
9. Яка структура є основою холестерину? Напишіть його формулу, загальну формулу ефірів холестеролу. Поясніть біологічну роль холестерину.