ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ - 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

7. УГЛЕВОДЫ И ГЛИКОБИОЛОГИЯ

7.5. Методы анализа углеводов

Растущее понимание важной роли олигосахаридов в процессах биологического узнавания подтолкнуло развитие методов анализа структуры и стереохимии сложных олигосахаридов. Анализ олигосахаридов затрудняется тем, что в отличие от пептидов и нуклеиновых кислот они могут разветвляться и соединяться при помощи разных типов связей. Высокая плотность зарядов многих полисахаридов и олигосахаридов и относительная лабильность сульфатных эфиров в гликозаминогликанах только усугубляют эти трудности.

Для простых линейных полимеров, таких как амилоза, положение гликозидных связей определяют путем обработки исходного полисахарида метилиодидом в сильнощелочной среде, в результате чего все свободные гидроксильные группы метилируются и становятся кислотоустойчивыми, а затем метилированный полисахарид гидролизуют в кислоте. Свободные гидроксильные группы в полученных таким образом производных моносахаридов — это те, что участвовали в образовании гликозидных связей в исходном полимере. Для определения последовательности моносахаридных звеньев и имеющихся разветвлений используют ферменты экзогликозидазы с известной специфичностью: они по очереди отщепляют моносахаридные остатки от невосстанавливающего конца цепи. Специфичность этих экзогликозидаз часто позволяет определить положение и стереохимию каждой связи.

Для анализа структуры олигосахаридной части гликопротеинов и гликолипидов олигосахаридную часть отщепляют с помощью очищенных ферментов. Гликозидазы специфическим образом расщепляют О- или N-олигосахаридные связи, а липазы удаляют «головки» липидов. Кроме того, связанные О-гликозидной связью гликаны можно выделить из гликопротеинов, обработав гидразином. Разделить полученную смесь сахаров на отдельные компоненты можно разными способами (рис. 7-36), включая те, что применяются для разделения белков и аминокислот: дробное осаждение растворителями и ионообменная и эксклюзионная хроматография (см. рис. 3-17). Очищенные лектины, прикрепленные к твердому носителю, часто применяются в аффинной хроматографии для разделения смесей сахаров (см. рис. 3-17, в).

При гидролизе олигосахаридов и полисахаридов под действием сильных кислот образуется смесь моносахаридов, которые можно идентифицировать с помощью хроматографических методов; таким образом можно установить общий состав полимера.

Рис. 7-36. Методы анализа углеводов. Для полной характеристики очищенного на первом этапе углевода иногда приходится применить все четыре аналитических подхода.

Анализ олигосахаридов все в большей степени осуществляется с помощью методов масс-спектрометрии и ЯМР-спектрометрии высокого разрешения. Для анализа таких полярных соединений, какими являются олигосахариды, можно использовать методы масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбционной ионизацией (МАLDI) и тандемной масс-спектрометрии (доп. 3-2). Метод МАLDI настолько чувствителен, что позволяет определять массу ионов (в данном случае целых олигосахаридных цепей; рис. 7-37). Методом тандемной масс-спектрометрии определяют, как массу ионов, так и их фрагментов, возникающих в результате разрыва гликозидных связей. Данные ЯМР (доп. 4-5) помогают определить последовательность моносахаридов, положения связи и конфигурацию аномерных атомов, особенно если дело касается олигосахаридов среднего размера. Например, структура участка гепарина, пространственная модель которой представлена на рис. 7-22, полностью была установлена по данным ЯМР- спектроскопии. Для рутинного определения структуры олигосахаридов используют автоматизированные методы и специальные при-

боры, однако определение последовательности разветвленного олигосахарида с несколькими тинами связей остается гораздо более сложной задачей, чем определение линейной последовательности белка или нуклеиновой кислоты.

Рис. 7-37. Разделение и количественный анализ олигосахаридов из смеси гликопротеинов. В данном эксперименте смесь белков, выделенных из почечной ткани, обрабатывали таким образом, чтобы отделить олигосахаридные цепи, которые затем анализировали методом масс-спектрометрии (МАLDI-МS). Каждому олигосахариду соответствует пик с определенной молекулярной массой, а площадь пика отражает количество этого олигосахарида в образце. Самый крупный пик соответствует олигосахариду с массой 2837,4, который состоит из 14 остатков. В том же образце обнаружены олигосахариды, содержащие 7 и 19 остатков.

Важная роль при анализе сахаров отводится химическому синтезу. Этот метод широко используется для изучения биологических функций гликозаминогликанов и олигосахаридов. Химия подобных процессов сложна, но современные методы позволяют синтезировать короткие фрагменты практически любого гликозаминогликана с требуемой стереохимической структурой, длиной и расположением сульфатных групп, причем синтезируемые олигосахариды могут иметь гораздо более сложную структуру, чем те, что изображены на рис. 7-29. Твердофазный синтез олигосахаридов основан на тех же принципах, что и синтез пептидов, и имеет те же преимущества (см. рис. 3-29). Однако в химии углеводов могут применяться особые приемы: защитные группы и активирующие группы должны обеспечивать синтез гликозидной связи с правильным расположением гидроксильных групп. Очищенные ферменты гликозилтрансферазы очень полезны для синтеза чистых химических соединений. Подобные синтетические методы представляют сегодня большой интерес, поскольку выделить из природного источника и получить в чистом виде определенный олигосахарид достаточно сложно. Для определения специфичности связывания можно использовать олигосахаридные микрочипы и лектины с флуоресцентной меткой (аналогично тому, как это описано в гл. 9 для ДНК-микрочипов).

Краткое содержание раздела 7.5 Методы анализа углеводов

■ Для полного установления структуры олигосахарида или полисахарида необходимо определить места разветвлений, последовательность моносахаридов в каждой ветви, конфигурацию каждого моносахаридного звена, а также положения гликозидных связей; эта задача по сложности намного превосходит

анализ последовательности белка или нуклеиновой кислоты.

■ Структуру олигосахаридов и полисахаридов обычно определяют, применяя комбинацию нескольких методов: специфический ферментативный гидролиз помогает определить стереохимию соединения и получить более мелкие фрагменты для анализа; метилирование и кислотный гидролиз позволяют локализовать гликозидные связи; последовательное расщепление дает информацию о последовательности моносахаридов и конфигурации аномерных атомов углерода.

■ Масс-спектрометрия и ЯМР-спектрометрия высокого разрешения позволяют из небольшого количества образца извлечь большой объем информации о последовательности звеньев, конфигурации аномерных и других атомов углерода, а также положения гликозидных связей.

■ Методы твердофазного синтеза позволяют получать олигосахариды заданной структуры, что очень важно для изучения взаимодействий олигосахаридов с лектинами и, кроме того, может иметь важное клиническое значение.