ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ - 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

8. НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Вопросы и задачи

1. Структура нуклеотидов.

Какие атомы пуринового цикла в пуриновом нуклеотиде ДНК могут образовывать водородные связи, но не участвуют в образовании уотсон-криковских пар?

2. Последовательность комплементарных цепей ДНК.

Известна одна цепь двойной спирали ДНК, которая имеет последовательность (5') GСGСАAТАТТТСТСААААТАТТGСGС (3'). Напишите последовательность нуклеотидов в комплементарной цени. Что особенного в последовательности этого сегмента ДНК? Может ли эта двуцепочечная ДНК образовывать разные структуры?

3. ДНК в теле человека.

Вычислите массу двойной спирали ДНК в граммах, если ее длина равна расстоянию от Земли до Луны (-320 000 км). Масса ДНК длиной 1000 пар нуклеотидов -1 • 10-¹⁸ г; расстояние между двумя соседними парами оснований составляет 3,4 А. Для информации, в вашем теле содержится примерно 0,5 г ДНК.

4. Изгибы молекул ДНК.

Предположим, что последовательность poly(А) из пяти оснований в цепи ДНК изгибается под углом 20°. Вычислите полный угол, на который отклонится цепь ДНК, если центральные пары оснований (третьи из пяти) в двух последовательностях (dА)5 будут находиться на расстоянии а) 10 пар нуклеотидов; б) 15 пар нуклеотидов. Учтите, что на один полный оборот двойной спирали ДНК приходится 10 пар оснований.

5. Различия между структурами ДНК и РНК.

Шпильки могут образовываться в местах палиндромных последовательностей либо в одной цепи РНК, либо в одной цепи ДНК. Чем спиральная структура длинной и полностью комплементарной (кроме конца) шпильки в РНК отличается от похожей шпильки в ДНК?

6. Химия нуклеотидов.

Клетки большинства эукариотических организмов имеют высокоспециализированную систему, которая точно распознает G-Т-несоответствия в ДНК. Такая неправильная пара оснований исправляется на пару G = С (не А = Т). Этот механизм исправления неправильной G-Т-пары дублирует более общую систему, которая исправляет практически все ошибки. Предположите, зачем клетке может потребоваться дополнительная специализированная система исправления G-Т ошибок.

7. Спонтанные повреждения ДНК.

Гидролиз N-гликозидной связи между дезоксирибозой и пурином в ДНК создает АР-сайт. В результате происходит дестабилизация ДНК, которая сильнее, чем в любом случае аномального спаривания. Это явление пока не до конца понятно. Изучите структуру AР-сайта (см. рис. 8-33, б) и опишите несколько химических последствий потери основания.

8. Структура нуклеиновых кислот.

Объясните, почему увеличивается поглощение УФ-света двойной спиралью ДНК (гиперхромный эффект) при ее денатурации.

9. Определение концентрации белка в растворе, содержащем белки и нуклеиновые кислоты.

Концентрация белка или нуклеиновой кислоты в растворе, содержащем оба полимера, может быть определена на основании различия в их спектральных характеристиках: максимум поглощения белков находится в области 280 нм, а нуклеиновых кислот — 260 нм. Относительная концентрация в растворе может быть определена измерением величины абсорбции (А) при 280 и 260 нм.

При вычислении их отношения R₂₈₀/₂₆₀ и с использованием таблицы, приведенной ниже, можно оценить массовую долю всех нуклеиновых кислот, а также фактор F, который корректирует величину А₂₈₀ и помогает более точно оценить содержание белка. Концентрация белка (в мг/мл) равна F • А₂₈₀ (для кюветы с длиной оптического пути 1 см). Вычислите концентрацию белка в растворе с поглощением A₂₈₀ ⁼ 0,69 и A₂₆₀ = 0,94.

10. Растворимость компонентов ДНК.

Напишите формулы следующих соединений и сравните их растворимость в воде: дезоксирибоза, гуанин, фосфат. Как растворимость этих веществ соотносится с трехмерной структурой двойной спирали ДНК?

11. Секвенирование ДНК по Сенгеру.

В методе секвенирования ДНК по Сенгеру (дидезокси-метод) небольшое количество дидезоксинуклеотидтрифосфата (скажем, ddСТР) добавляют в реакционную смесь наряду с гораздо большим количеством соответствующего дезоксинуклеотидтрифосфата (в данном случае dСТР). Каков был бы результат реакции при отсутствии в смеси dСТР?

12. Секвенирование ДНК.

Следующий фрагмент ДНК был секвенирован по методу Сейгера. Красная точка обозначает флуоресцентную метку.

Образец ДНК инкубировали с ДНК полимеразой и каждой из смесей нуклеотидов (в соответствующем буфере), приведенных ниже. Дидезоксинуклеотиды (ddNТР) были добавлены в относительно небольших количествах.

Полученные молекулы ДНК были разделены электрофорезом в агарозном геле, и идентифицированы места расположения флуоресцентных полосок. Картина электрофореза, полученная при разделении смеси 1, показана ниже. Учитывая, что все остальные смеси разделяли в этом же геле, укажите, где расположены остальные полосы?

13. Фосфодиэстераза из яда змей.

Экзонуклеаза — это фермент, который последовательно отщепляет нуклеотиды с конца полинуклеотидной цепочки. Фосфодиэстераза из яда змей, которая гидролизиует нуклеотиды с 3'-конца любого олигонуклеотида, содержащего свободную 3'- гидроксильную группу, разрезает связь между 3'-гидроксильной группой рибозы или дезоксирибозы и фосфатной группой следующего нуклеотида. Ее действию подвергаются одноцепочечные молекулы ДНК или РНК; она не имеет специфичности по основаниям. Этот фермент использовался для определения последовательности до того, как были развиты современные методы секвенирования нуклеиновых кислот. Какие продукты образуются при частичной обработке

олигонуклеотида со следующей последовательностью фосфодиэстеразой из яда змей?

(5') GCGCCAUUGC (3')-ОН

14. Сохранение ДНК в эндоспорах бактерий.

Бактериальные эндоспоры образуются, когда условия окружающей среды не способствуют активному клеточному метаболизму. У почвенной бактерии Bacillus subtilis,например, процесс спорообразования начинается, если недостает хотя бы одного из необходимых питательных веществ. В результате образуется маленькая, метаболически неактивная структура, которая может жить практически неограниченное время с минимальным уровнем метаболизма. Споры используют механизм для предотвращения накопления потенциально летальных мутаций в их ДНК за периоды покоя, которые могут превышать тысячи лет. Споры В. subtilis более устойчивы к действию радиации и мутагенных окислителей, чем растущие клетки.

а) Одним из факторов, которые предотвращают возможное повреждение ДНК в спорах, является значительное уменьшение содержания воды. Как этот фактор может повлиять на некоторые из типов мутаций?

б) Эндоспоры содержат класс белков, которые называются небольшими кислоторастворимыми белками (от англ. small acid-soluble proteins, SASP); они связываются с ДНК, что предотвращает образование циклобутановых димеров. Что вызывает образование димеров и почему эндоспоры бактерий должны иметь механизм, предотвращающий их образование?

15. Синтез олигонуклеотидов.

В схеме на рис. 8-35 каждое следующее основание, добавляемое к растущей олигонуклеотидной цепи, модифицировано таким образом, что его 3'-гидроксильная группа активирована, а к 5'-гидроксильной группе присоединена диметокситритильная группа (DMT). Какова функция диметокситритильной группы?

Биохимия в Интернете

16. Структура ДНК.

Открытие пространственной структуры ДНК помогло исследователям понять, как эта молекула передает информацию, которая может безошибочно перейти от одного поколения к следующему. Чтобы посмотреть на вторичную структуру двойной спирали ДНК, откройте веб-сайт банка данных белковых структур, Protein Data Bank, PDB(www.rcsb.org/pdb). Используйте идентификаторы PDB, список которых приведен ниже, для того чтобы найти данные для двух форм ДНК. Посмотрите на структуры, используя программы RasMol или Chime, и выполните следующие упражнения, используя различные опции для просмотра.

а) Найдите файл 141D для высококонсервативной повторяющейся последовательности ДНК с конца генома ВИЧ-1 (вирус, который вызывает СПИД). Изобразите структуру молекулы в виде палочек, или шаростержневой модели (в меню контроля выберите Select> All, затем Render> Scheme > Ball and Stick). Укажите положение сахарофосфатного остова для каждой цени ДНК. Найдите месторасположение и определите тип отдельных оснований. Который из концов — 5'-конец? Покажите большую и малую бороздки. Какая это спираль — правозакрученная или левозакрученная?

б) Откройте файл 145D, ДНК в Z-конформации. Изобразите структуру молекулы в виде палочек, или шаро-стержневую модель. Покажите большую и матую бороздки. Какая это спираль — правозакрученная или левозакрученная?

в) Для того чтобы полностью разобраться во вторичной структуре ДНК, посмотрите на стереоизображение молекулы. В меню контроля выберите Select> All, затем Render > Stereographic > Cross-eyed или Wall-eyed. Вы увидите два изображения молекулы ДНК. Сядьте так, чтобы ваше лицо находилось на расстояние примерно 25 см от монитора, и сфокусируйте взгляд на кончике носа (cross-eyed) или на противоположном крае экрана (wall-eyed). На заднем плане вам должно быть видно три изображения спирали ДНК. Переведите взгляд с кончика носа на центральное изображение, которое должно быть трехмерным. (Учтите, что так умеет делать только один из двух авторов этого учебника.)

Анализ экспериментальных данных

17. Исследования структуры ДНК, проведенные Чаргаффом.

В подразделе «ДНК — это двойная спираль, хранящая генетическую информацию» приводятся некоторые основные заключения Эрвина Чаргаффа, сформулированные в виде четырех правил («Правила Чаргаффа»). В данной задаче мы рассмотрим те данные, которые Чаргафф привел в подтверждение своих заключений. В одной работе (1950 г.) он описал свой метод анализа и представил несколько первых результатов. Если говорить коротко, он обрабатывал образцы ДНК кислотой, чтобы удалить основания, разделял основания с помощью бумажной хроматографии и измерял количество каждого основания с помощью УФ- спектроскопии. Полученные результаты представлены ниже в трех таблицах. Молярное отношение — это отношение числа молей каждого основания в образце к числу молей фосфата в этом образце (эта цифра показывает, какую долю от общего числа оснований составляет данное основание). Выход — это сумма всех четырех оснований (сумма молярных отношений); полная сумма всех оснований в ДНК должна составлять единицу.

Молярное отношение в ДНК быка

Молярное отношение в ДНК человека

Молярное отношение в ДНК микроорганизмов

а) На основании этих данных Чаргафф заключил, что «не обнаружено различий состава

ДНК в исследованных до сих пор образцах из разных тканей организма одного и того же вида». Это соответствует заключению 2 (разд. 8.2). Однако скептик, разглядывающий приведенные выше данные, определенно мог бы сказать, что для него они, безусловно, имеют отличия. Если бы вы были Чаргаффом, как бы вы на основании этих данных могли убедить скептика изменить свое мнение?

б) Состав оснований ДНК в нормальной и раковой (клетке гепатокарциномы) клетках печени практически одинаков. Как вы думаете, мог ли метод, использованный Чаргаффом, позволить найти различия ДНК в нормальной и в раковой клетках? Объясните свой ответ. Как можно было ожидать, результаты Чаргаффа не были абсолютно убедительными. Он усовершенствовал свой метод и описал это в следующей работе (1951 г.), в которой привел молярные отношения для оснований ДНК из различных организмов:

в) Согласно Чаргаффу, как сказано в заключении 1, состав оснований ДНК у различных видов организмов сильно различается. Подтвердите это утверждение на основании приведенных выше данных.

г) В соответствии с выводом 4 (см. с. 400), в ДНК любой клетки, независимо от вида А + G = Т + С. Подтвердите это утверждение с помощью представленных выше данных.

До некоторой степени исследования Чаргаффа были направлены на опровержение тетрануклеотидной гипотезы о строении ДНК, согласно которой ДНК является монотонным тетрануклеотидным полимером состава (АGСТ)_n, последовательность которого, естественно, не может нести в себе никакой информации. Хотя представленные выше данные показывают, что ДНК не является простым тетрануклеотидом (в противном случае все образцы имели бы одинаковые молярные отношения 0,25 для всех оснований), однако сохраняется возможность, что ДНК в разных организмах представляет собой более сложную, но все же монотонно повторяющуюся последовательность. Для решения этого вопроса Чаргафф взял ДНК из проростков пшеницы и обрабатывал ее ферментом дезоксирибонуклеазой в течение разных промежутков времени. Через каждый промежуток времени некоторая доля ДНК разваливалась на мелкие фрагменты. Оставшиеся более крупные фрагменты Чаргафф назвал «ядром». В таблице в столбце «19% ядра» представлено относительное количество оснований, присутствующих в более крупных фрагментах, оставшихся после деградации 81% ДНК; в столбце «8% ядра» представлено относительное количество оснований, присутствующих в более крупных фрагментах, оставшихся после деградации 92% ДНК.

д) Как на основании этих данных доказать, что ДНК зародышей пшеницы не является монотонным повторением определенной последовательности?