ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ - 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

12. БИОСИГНАЛИЗАЦИЯ

Вопросы и задачи

1. Эксперименты с гормоном в бесклеточных системах.

В 1950-х гг. Эрл Уилбур Сазерленд мл. и его коллеги провели пионерные эксперименты для выяснения механизма действия адреналина и глюкагона. Используя материал данной главы, интерпретируйте каждый из описанных ниже опытов. Идентифицируйте вещество X и продемонстрируйте значимость результатов.

а) Добавление адреналина в гомогенат нормальной печени приводило к увеличению активности гликогенфосфорилазы. Однако если гомогенат предварительно подвергали центрифугированию с высокой скоростью, а адреналин или глюкапж добавляли в прозрачную надосадочную фракцию, содержащую фосфорилазу, никакого увеличения активности не происходило.

б) Когда полученную в результате центрифугирования фракцию, содержащую частицы, обрабатывали адреналином, происходило образование вещества X. Это вещество было выделено и очищено. В отличие от адреналина вещество X активировало гликогенфосфорилазу при добавлении к прозрачному супернатанту, полученному при центрифугировании гомогената.

в) Вещество X было устойчиво к нагреванию, т. е. тепловая обработка не влияла на его способность активировать фосфорилазу. (Подсказка: могло ли это происходить, если бы вещество X представляло собой белок?) Вещество X было почти идентично соединению, получаемому при обработке чистого АТР гидроксидом бария (см. рис. 8-6).

2. Сравнение влияния дибутирил-сАМР и сАМР на интактные клетки.

Физиологическое действие адреналина в принципе можно имитировать добавлением сАМР к клеткам-мишеням. На практике добавление сАМР к интактным клеткам- мишеням вызывает только самый минимальный физиологический ответ. Почему? Когда структурно родственное производное дибутирил-сАМР (изображен ниже) добавляют к интактным клеткам, ожидаемый физиологический ответ совершенно очевиден. Объясните основу различия в клеточном ответе на эти два вещества. Дибутирил-сАМР широко применяется в исследованиях функций сАМР.

■ 3. Действие холерного токсина на адени- латциклазу.

Грамотрицательная бактерия Vibrio cholerae вырабатывает белок — холерный токсин (Мr = 90 000), обусловливающий характерный симптом холеры: огромную потерю организмом воды и Na⁺вследствие непрерывной изнурительной диареи. Жидкость и Na⁺ в организме нс пополняются, происходит сильное обезвоживание; в отсутствие лечения болезнь всегда кончается смертью. Когда холерный токсин получает доступ в кишечный тракт, он прочно связывается со специфическими центрами на плазматической мембране эпителиальных клеток, выстилающих тонкий кишечник, вызывая длительную активацию аденилатциклазы (в течение часов или дней).

а) Как влияет холерный токсин на концентрацию сАМР в клетках кишечника?

б) Основываясь на приведенной выше информации, предположите, как в норме функционирует сАМР в клетках кишечного эпителия.

в) Предложите возможный способ лечения холеры.

4. Мутации в РКА.

Объясните, как мутации в R- или С-субъединице сАМР-зависимой протеинкиназы (РКА) могут приводить а) к постоянно активной РКА или б) к постоянно ингибированной РКА.

5. Терапевтические эффекты альбутерола.

Нарушение дыхания при астме возникает из- за спазма бронхов и бронхиол легких вследствие сокращения гладкой мускулатуры их стенок. Этот спазм может быть снят путем увеличения концентрации сАМР в гладких мышцах. Объясните терапевтические эффекты альбутерола, β-адренергического агониста, принимаемого (путем ингаляции) при астме. Как вы думаете, вызывает ли это лекарство какие-либо побочные действия? Как создать лекарство, не имеющее этих побочных эффектов?

6. Прерывание гормональных сигналов.

Сигналы, передаваемые гормонами, в конце концов должны быть прерваны. Опишите несколько разных механизмов торможения сигнала.

7. Использование FRET для изучения белок- белковых взаимодействий in vivo.

На рис. 12-8 изображено взаимодействие между β-аррестином и β-адренергическим рецептором. Как с помощью метода FRET (см. доп. 12-3) продемонстрировать наличие этого взаимодействия в живых клетках? Слияние каких белков следует произвести? Светом с какой длиной волны нужно облучать клетки, а при какой длине волны следить за происходящими изменениями? Какие изменения можно наблюдать, если исследуемое взаимодействие происходит? А если взаимодействия нет? Как объяснить невозможность демонстрации этого взаимодействия с помощью данного метода?

8. Введение ЭГТА. ЭГТА (этиленгликоль-N, N'- (β-аминоэтиловый эфир) N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты) является хелатирующим агентом с высоким сродством и специфичностью по отношению к Са²⁺.

Делая микроинъекции соответствующего раствора Са²⁺-ЭДТА в клетку, экспериментатор может предотвратить рост концентрации Са²⁺ в цитозоле выше 10^-7 М. Как изменила бы микроинъекция ЭДТА клеточный ответ на вазопрессин (см. табл. 12-5)? На глюкагон?

9. Усиление гормональных сигналов.

Опишите все источники усиления в системе инсулинового рецептора.

10. Мутации ras.

Как мутация гена ras, приводящая к образованию белка Ras, не обладающего СТРазной активностью, изменяет клеточный ответ на инсулин?

11. Различия в G-белках.

Сравните G-белки G_s (работают при передаче сигнала от β-адренергических рецепторов) и Ras. Какие свойства являются для них общими? Чем они отличаются? В чем функциональное различие между G_s и G¡?

12. Механизмы регуляции протеинкиназ.

Укажите восемь главных типов протеинкиназ, обнаруженных в клетках эукариот, и объясните, какой фактор непосредственно отвечает за активацию каждого типа.

13. Негидролизуемые аналоги GTP.

Многие ферменты могут гидролизовать GTP между β- и y-фосфатами. Аналог GTP β,y-имидогуанозин-5'- трифосфат Gpp(NH)p, изображенный ниже, не гидролизуется между β- и y-фосфатами. Предскажите эффект микроинъекции Gpp(NH)p в миоциты на клеточный ответ при β-адренергической стимуляции.

14. Использование токсина для очистки белка ионного канала.

α-Бунгаротоксин — мощный нейротоксин из яда змеи Bungarus multicinctus. Он с высокой специфичностью связывается с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами и мешает открыванию ионных каналов. Это взаимодействие использовали для выделения и очистки ацетилхолинового рецепторного белка из электрического органа ската.

а) Объясните стратегию выделения ацетилхолинового рецептора с помощью α-бунгаротоксина, ковалентно связанного с хроматографическими гранулами. (Подсказка: см. рис. 3-17, в.)

б) Объясните стратегию очистки ацетилхолинового рецептора с помощью [I125] α-бунгаротоксина.

15. Мембранный потенциал покоя.

Множество необычных беспозвоночных, в том числе гигантские моллюски, мидии и полихеты, живут на краях гидротермальных источников на дне океана, где температура составляет 60 °С.

а) Мембранный потенциал покоя замыкающего мускула глубоководного гигантского моллюска — 95 мВ. Могли бы вы предсказать этот мембранный потенциал по данным следующей таблицы? Почему да или почему нет?

б) Считайте, что мембрана замыкающего мускула проницаема только для ионов, перечисленных выше. Какой ион определяет мембранный потенциал Vm?

16. Мембранные потенциалы в икринках лягушки.

Оплодотворение яйцеклетки лягушки сперматозоидом приводит в действие ионные каналы, похожие на каналы нейронов (в процессе распространения потенциала действия), и инициирует события, приводящие к делению клетки и развитию эмбриона. Ооциты можно простимулировать к делению без оплодотворения, суспендируя их в 80 мМ КСl (обычная прудовая вода содержит 9 мМ КСl).

а) Рассчитайте, как изменение внеклеточной концентрации КСl изменит мембранный потенциал покоя ооцита. (Подсказка: считайте, что ооцит содержит 120 мМ К- и проницаем только для К-.) Примите температуру равной 20 °С.

б) Когда эксперимент повторяют в воде, не содержащей Са²⁺, увеличение концентрации КСl не оказывает эффекта. На какие мысли это наводит относительно механизма действия КСl?

17. Возбуждение, вызываемое гиперполяризацией.

В большинстве нейронов деполяризация мембраны приводит к открытию потенциалзависимых ионных каналов, генерации потенциала действия и в конце концов к входу Са²⁺, вызывающему высвобождение нейромедиатора в окончании аксона. Разработайте клеточную стратегию, при которой гиперполяризация в палочках сетчатки вызывала бы возбуждение зрительного сигнального пути и прохождение зрительного сигнала в головной мозг. (Подсказка: передача нервных импульсов у высших организмов проходит через серию нейронов, которые переносят информацию в мозг (см. рис. 12-35). Сигнальный фактор, высвобожденный одним нейроном, может быть либо возбуждающим, либо тормозным относительно следующего, постсинаптического нейрона.)

18. Генетические «каналопатии».

Многие генетические заболевания связаны с дефектами ионных каналов. Для каждого из описанных ниже случаев объясните, какое молекулярное нарушение могло привести к данным симптомам.

а) Мутация с потерей функции гена, кодирующего α-субъединицу cGMP-зависимого катионного канала колбочек сетчатки, приводит к полной неспособности различать цвета.

б) Нефункциональные аллели гена, кодирующего α-субъединицу АТР-зависимого калиевого канала (см. рис. 23-29), приводят к состоянию, называемому врожденным гиперинсулинизмом, при котором в крови постоянно повышен уровень инсулина.

в) Мутация β-субъединицы АТР-зависимого калиевого капала, нарушающая связывание АТР, приводит к диабету новорожденных — постоянно пониженному уровню инсулина в крови у новорожденных детей.

19. Зрительная десенситизация.

Болезнь Огучи представляет собой наследуемую форму ночной слепоты. Подверженные ей люди медленно восстанавливают зрение после вспышки яркого света на фоне темноты (например, света автомобильных фар на шоссе). Сделайте предположение, какие молекулярные дефекты (или дефект) могут иметь место при болезни Огучи. Поясните на молекулярном уровне, как этот дефект объясняет ночную слепоту.

20. Влияние проникающего аналога cGMP на палочки сетчатки.

Аналог cGMP, 8-Br-cGMP, способный проникать сквозь клеточную мембрану, очень медленно разрушается под действием фосфодиэстеразной активности в палочках сетчатки, но эффективно вызывает открытие управляемого канала во внешнем сегменте клетки так же, как cGMP. Что можно наблюдать, если подействовать светом на суспензию палочек в буфере со сравнительно высокой концентрацией 8-Вг- cGMP, измеряя при этом мембранный потенциал клеток?

21. Ощущение горячего и холодного при приеме пищи.

Ощущения горячего и холодного передаются группой регулируемых температурой катионных каналов. Например, каналы TRPV1, TRPV3 и TRPM8 обычно закрыты, но открываются при следующих условиях: TRPV1 при t ≥ а 43 °С, TRPV3 при t ≥ 33 °С, a TRPM8 при t <25 °С. Эти каналы экспрессируются в чувствительных нейронах, которые отвечают за тепловые ощущения.

а) Предложите модель, объясняющую, каким образом действие высокой температуры на чувствительный нейрон, содержащий TRPV1, приводит к ощущению тепла.

б) Капсаицин — один из активных компонентов жгучего перца — агонист TRPV1. В концентрации 32 нМ это вещество на 50% активирует ответ TRPV1 (т. е. ЕС50 капсаицина составляет 32 нМ). Объясните, почему всего несколько капель соуса, в состав которого входит жгучий перец, вызывают ощущение горячего, на самом деле не обжигая рот.

в) Ментол, входящий в состав мяты, является агонистом TRPM8 (ЕС₅₀ = 30 мкМ) и TRPV3 (ЕС₅₀ = 20 мМ). Какое ощущение вы испытаете, взяв в рот небольшое количество ментола? А если взять много ментола?

22. Онкогены, гены опухолевых супрессоров и рак.

Объясните, почему в каждой из описанных ниже ситуаций может происходить неконтролируемое деление клеток.

а) При раке толстой кишки часто возникают мутации гена, кодирующего рецептор простагландина Е₂. Простагландин PGE₂— это фактор роста, необходимый для деления клеток желудочно- кишечного тракта.

б) Саркома Капоши часто обнаруживается у больных СПИДом при отсутствии лечения. Этот вид рака вызван вирусом, один из генов которого кодирует белок, напоминающий хемокиновые рецепторы CXCR1 и CXCR2. Хемокины — это специфические для определенного типа клеток ростовые факторы.

в) Аденовирус, приводящий к возникновению рака, несет ген белка E1 А, который связывается с белком ретинобластомы pRb. (Подсказка: см. рис. 12-48.)

г) Многие онкогены и гены опухолевых супрессоров специфичны для определенного тина клеток. Например, мутации рецептора PGE₂ обычно не встречаются при раке легкого. Объясните это наблюдение. (Напомним, что PGE₂ действует посредством GPCR в плазматической мембране.)

23. Мутации в генах опухолевого супрессора и онкогенах.

Объясните, почему мутации в генах опухолевого супрессора являются рецессивными (обе копии гена должны иметь дефекты, для того чтобы была нарушена регуляция клеточного деления), в то время как мутации в онкогенах являются доминантными.

24. Ретинобластома у детей.

Объясните, почему у некоторых детей с ретинобластомой развиваются множественные опухоли сетчатки в обоих глазах, в то время как другие имеют единичную опухоль только в одном глазу.

25. Специфичность сигнала для отдельных типов клеток.

Обсудите справедливость следующего предположения: «сигнальная молекула (гормон, фактор роста или нейромедиатор) вызывает идентичные ответы в различных типах клеток- мишеней, если последние содержат одинаковые рецепторы».

Анализ экспериментальных данных

26. Вкусовые ощущения у мышей.

На рис. 12-41 изображен путь передачи сигнала сладкого вкуса у млекопитающих. Приятный вкус обусловлен эволюционной адаптацией, способствующей потреблению животными питательных продуктов. Жао с соавторами (2003) изучали два главных приятных вкусовых ощущения — сладость и вкус умами*. Пикантный вкус умами связан с наличием в продуктах определенных аминокислот, особенно аспарагиновой и глутаминовой кислот; возможно, именно этот вкус заставляет животных есть богатую белками пищу. Усилитель вкуса глутамат натрия усиливает это вкусовое ощущение. В период публикации данной статьи было проведено исследование специфических вкусовых рецепторов (названных SR на рис. 12-41) для сладкого и умами. Было известно три таких рецепторных белка (Т1R1, Т2R2 и ТЗR3), которые функционируют как гетеродимерные комплексы: экспериментальным путем было установлено, что комплекс Т1R1-Т1RЗ является рецептором умами, а комплекс Т1R2-Т1RЗ — рецептором сладкого. Каким же образом вкусовое ощущение кодируется и посылается в мозг? Для этого процесса были предложены две модели. В клеточной модели предполагается, что отдельные сенсорные клетки экспрессируют только один тип рецептора; т. е. существуют «сладкие клетки», «горькие клетки», «клетки умами» и т. д., и клетки каждого типа посылают информацию в головной мозг посредством разных нервных клеток. Мозг «узнает» вкус на основании того, какое именно нервное волокно передает сигнал. В рецепторной модели предполагается, что отдельные сенсорные клетки имеют несколько типов рецепторов и передают различные сигналы в мозг по одному и тому же нервному волокну, однако сигнал зависит от того, какой рецептор активирован. В то время также было неизвестно, как связаны между собой различные вкусовые ощущения и нужны ли элементы системы восприятия одного вкуса для восприятия другого вкуса.

* Вкус умами — вкус белковых веществ, характерный для блюд японской и вообще восточной кухни. На русский язык умами иногда переводят как «мясной вкус». — Прим. пер.

а) В одной из работ было показано, что различные рецепторные белки экспрессируются в неперекрывающихся наборах рецепторных клеток. Какую из двух описанных выше моделей подкрепляет это заключение? Объясните свой ответ.

Жао с коллегами получили мышей, обладающих гомозиготными аллелями, кодирующими один нефункциональный рецепторный белокм (Т1R1, Т1R2 или Т1RЗ), а также кодирующими одновременно два нефункциональных рецепторных белка — Т1R2 и Т1RЗ. Восприятие вкуса этими животными оценивали по тому, как часто они лизали растворы с тем или иным вкусом. Мыши облизывали горлышко бутыли с вкусной жидкостью чаще, чем с невкусной. Измеряли «относительную частоту облизывания», т. е. определяли, насколько чаще животные облизывали горлышко данной бутыли по сравнению с горлышком бутыли с водой. Если значение этого параметра было равно единице, это означало, что животные не оказывали никакого предпочтения данной жидкости, значение параметра меньше единицы означало антипатию, значение больше единицы — предпочтение.

б) Все четыре линии мышей с «выключенными» генами продемонстрировали такое же отношение к соленым и горьким жидкостям, что и мыши дикого типа. Какую из описанных выше гипотез подтверждает это заключение? Какой вывод можно сделать на основании этих результатов?

Далее исследователи изучали рецепторы вкуса умами, измеряя «относительную частоту облизывания» растворов с разным содержанием глутамата натрия мышами различных линий. В растворе, кроме того, содержался ионозинмонофосфат, усиливающий восприятие вкуса умами (обычный компонент японского супа рамэн, наряду с глутаматом натрия), а также амелорид, подавляющий приятный соленый вкус, связанный с присутствием натрия (из глутамата натрия). Результаты эксперимента представлены в виде графика.

в) Согласуются ли эти данные с тем фактом, что рецепторы вкуса умами представляют собой гетеродимер, состоящий из белков Т1R1 и Т1RЗ, и почему?

г) Какую из моделей кодирования вкуса подтверждают эти данные? Объясните свои рассуждения.

Далее Жао с соавторами предприняли серию аналогичных экспериментов со сладким вкусом, используя для этого сахарозу. Результаты экспериментов представлены ниже.

д) Согласуются ли эти данные с тем фактом, что рецепторы сладкого вкуса представляют собой гетеродимер, состоящий из белков Т1R2 и Т1RЗ, и почему?

е) При очень высокой концентрации сахарозы были получены неожиданные результаты. Как это усложняет представленную выше модель гетеродимерного комплекса?

Кроме сахаров люди воспринимают сладкими и другие вещества (например, пептиды монеллин и аспартам), а мыши не воспринимают их сладкими. Жао с соавторами ввели в геном мыши с «выключенным» Т1R2 копию человеческого гена Т1R2 под контролем мышиного промотора Т1R2. Такие мыши воспринимали монеллин и сахарин сладкими. В следующем эксперименте мышам с «выключенным» геном Т1R1 вводили ген белка RASSL — G-белок- связанного рецептора для синтетического опиата спирадолина. Ген RASSL находился под контролем промотора, который индуцировался при введении в пищу мышей тетрациклина. Такие мыши не оказывали предпочтения спирадолину в отсутствие тетрациклина, но при добавлении тетрациклина в пищу животные явно предпочитали растворы с наномолярной концентрацией спирадолина.

ж) Как эти результаты подтверждают выводы Жао и его коллег относительно механизма передачи вкусовых ощущений?